高效液相色谱法测定蛋白粉中的三聚氰胺.docVIP

高效液相色谱法测定蛋白粉中的三聚氰胺 　　摘要：蛋白粉经萃取，过ＰＣＸ柱提纯后，采用Ｓｙｍｍｅｔｒｙ－Ｃ１８柱，以庚烷磺酸钠缓冲溶液－甲醇为流动相，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，测定蛋白粉中三聚氰胺的含量。该方法在１～１００．０ ｍｇ／Ｌ范围内，相对标准偏差小于０．０４％，标准曲线呈良好的线性关系，最低检出限为１．０ ｍｇ／Ｌ，样品加标回收率为９８．７％～１０４．０％，相对标准偏差小于０．４％，该方法能快速有效地测定蛋白粉中三聚氰胺的含量。 　　关键词：三聚氰胺；阳离子交换柱；蛋白粉 　　中图分类号：Ｒ９９１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11402－0378-03 　　 　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｗｄｅｒ ｗｉｔｈ ＨＰＬＣ 　　 　　ＳU Ａｉ-ｍｅｉ，ＬI Ｆｅｎｇ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ of ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｗｄｅｒ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ． Ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＸ ｃｏｌｕｍｎ， ｔｈｅｎ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｉｎ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ－Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ of ｓｏｄｉｕｍ ｈｅｐｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｔ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｆｏｒ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｏｆ １～１００．０ ｍｇ／Ｌ with relative standard deviation was less than 0.4%， ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｗａｓ １．０ ｍｇ／Ｌ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ９８．７％ ｔｏ １０４％ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ０．0４％． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ waｓ ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｏｎｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｗｄｅｒ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｌａｍｉｎｅ； ＰＣＸ ｃｏｌｕｍｎ； ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｗｄｅｒ 　　 　　德国化学家李比希在１８３４年最早合成了三聚氰胺。该化合物作为一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺－甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。由于三聚氰胺每分子中的氮元素比例较大，测定掺假饲料和食品中的蛋白质含量时，常规定氮方法会将三聚氰胺中的氮误判为蛋白质中的氮，使得蛋白质结果偏高。因此少数不法商贩将其添加到饲料和食品中，冒充蛋白质，导致了动物体内、动物产品及食品中三聚氰胺的残留问题，危害动物及人体健康。例如２００７年“宠物饲料事件”和２００８年“三鹿奶粉事件”，都极大损害了消费者利益和我国饲料工业以及奶业的国际声誉。本实验通过高效液相色谱对蛋白粉中三聚氰胺进行测定，可为三聚氰胺的快速分析提供实验依据。 　　１材料与方法 　　１．１仪器 　　Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪，Ｗａｔｅｒｓ １５２５泵，Ｗａｔｅｒｓ ２４８７双通道紫外检测器，Ｂｒｅｅｚｅ色谱系统管理工作站，色谱柱：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ－Ｃ１８柱，阳离子交换小柱。 　　１．２试剂 　　三聚氰胺：分析纯，纯度不低于９９．５％；三聚氰胺标准溶液：精密称取三聚氰胺１０．０ ｍｇ，以流动相定容至１０ ｍＬ，作为标准液；乙醇、甲酸为分析纯；０．０１ ｍｏｌ／Ｌ庚烷磺酸钠溶液，用柠檬酸调节ｐＨ值为３．３；乙腈：色谱纯；实验用水为去离子水。 　　１．３仪器测定条件 　　检测波长设为２４０ ｎｍ；流动相为庚烷磺酸钠缓冲溶液－甲醇；流速设为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；进样量为２０ μＬ。 　　１．４线性关系 　　用２０％甲醇－水溶液将三聚氰胺标准液稀释成１、５、１０、２５、５０及１００ ｍｇ／Ｌ系列标准工作液，过０．４５ μｍ滤膜过滤后，进色谱系统分析。以标准工作液浓度及其峰面积做线性回归分析，得标准工作曲线及线性方程。 　　１．５样品处理 　　１．５．１样品的提取准确称取５ ｇ左右蛋白粉至具塞锥形瓶中，加入１％三氯乙酸２０ ｍＬ，超声波振荡提取２０ ｍｉｎ，取部分溶液转移至１０ ｍＬ离心管中，７ ５００ ｒｐｍ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液３ ｍＬ过混合型阳离子交换小柱。 　　１．５．２样品净化活化及平衡：３ ｍＬ甲醇，３ ｍＬ水；上样：加入提取液３