端粒和端粒酶的发现过程.docVIP

端粒和端粒酶的发现过程 2009年诺贝尔生理学或医学奖授予了UCSF（加州大学旧金山分校）的Elizabeth Blackburn（简称Liz），Johns Hopkins University（约翰霍普金斯大学）的Carol Greider（简称Carol），以及Howard Medical School（哈佛大学医学院）的Jack Szostak。他们获奖的原因是揭示了“染色体是如何被端粒和端粒酶保护的”。 20世纪70年代初，对DNA聚合酶特性的深入了解引申出了一个染色体的复制问题。DNA聚合酶在复制DNA的时候必须要有引物来起始，而且它的酶活性具有方向性。染色体复制之初可以由小RNA作为引物起始合成，之后DNA聚合酶可以以反链DNA为模板，以之前合成的DNA为引物，合成新的DNA取代染色体中间的RNA引物。但是线性染色体最末端的RNA引物因为没有另外的引物起始，没有办法被DNA取代。所以线性染色体DNA每复制一轮，RNA引物降解后末端都将缩短一个RNA引物的长度。尽管这个引物不长，但是细胞千千万万代地不断复制，如果不进行补偿，染色体不断缩短，最终就会消失。James Watson（因为发现DNA双螺旋结构获得诺奖）最早就明确指出了这个“末端隐缩问题”，并猜想染色体也许可以通过在复制前联体（染色体末端跟末端连起来）的方式来解决末端复制的问题。 早在1939年，潜心玉米遗传性状研究的Barbara McClintock女士（因为发现玉米的转座子获得诺贝尔奖）注意到，在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新融合起来形成“桥”。在紧接着的有丝分裂中，这种染色体“断裂－融合－桥－断裂”的循环不断继续。既然染色体的断裂末端容易相互融合，那么染色体的自然末端，为什么不容易相互融合呢？合理的推测是，染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端，它应该有一个特殊的结构来避免染色体之间的相互融合。 在逐渐明晰了染色体末端特殊结构的概念之后，不妨给它一个专有名称-端粒。 四膜虫的小染色体众多，也就说端粒可能非常丰富。这就为端粒研究提供了得天独厚的材料。1978年，Liz女士利用这种特殊的模式生物纯化了rDNA，以rDNA为模板通过体外合成参入dNTP的实验，推断四膜虫的端粒是由许多重复的5-CCCCAA-3六个碱基序列组成的。第一个谜底揭开了，重复序列，端粒DNA果然特殊，序列本身隐隐暗示着解决染色体末端的隐缩问题和保护问题的机制。 1980年，当Liz女士在会议上报告她的这一发现的时候，引起了Jack Szostak的极大兴趣。他那时候试图在酿酒酵母中建构人工线性染色体，让它能够在细胞中像自然染色体一样复制。但是当环状质粒线性化转入酵母细胞后，它很快地被降解掉。它的降解是不是因为它的末端没有端粒序列保护呢？端粒序列的发现让Jack Szostak有机会把质粒末端连接上四膜虫的端粒DNA，然后再导入酵母细胞。奇迹发生了，线性质粒不再降解，它可以在细胞内复制，人工染色体的想法实现了。 1984年，Liz实验室通过将酵母端粒克隆到线性人工染色体的方法，发现酵母的端粒序列是由不太规则的TG1-3/C1-3A重复序列组成的。 1984年，Carol女士作为博士生加盟了Liz实验室。她们俩精心讨论设计实验，用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温育，试图在体外检测到这个“酶”活性，看到端粒的延伸。经过不断优化条件，尤其是把底物换成体外合成的高浓度的端粒DNA后，同年的圣诞节，勤奋的Carol同学打开暗盒曝光x光片，终于清楚地看到了“酶”活性。在测序胶的同位素曝光片上，端粒底物明显被从新加上了DNA碱基，而且每六个碱基形成一条很深的带，与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合。这种酶活性不依赖于模板，只对四膜虫和酵母的端粒DNA进行延伸，而对随机序列的DNA底物不延伸；并且该活性不依赖于DNA聚合酶。由于同源重组对序列没有特异性的要求并且依赖于DNA聚合酶的活性，至此，她们澄清了这两种假说，证明了有一种“酶”来延伸端粒DNA。这种酶后来被命名为“端粒酶”。 紧接着她们对端粒酶活性进一步定性。此时Tom Cech（因为发现RNA可以有酶活性获得诺贝尔奖）正好访问Liz的实验室，她/他们一起做了个简单的实验，就是用RNA酶处理样品，降解样品的RNA，看看端粒酶活性是否受到影响。结果是酶活性竟然消失了，端粒酶活性依赖于RNA。端粒酶会不会是另外一种特殊的RNA酶？想必从这个时候，Tom Cech 开始被端粒酶深深吸引，并介入了这个领域。当然那时候也知道端粒酶是依赖于蛋白的：用蛋白酶消化后的样品也不具备端粒酶活性。1989年，Carol通过跟踪端粒酶活性，用柱子纯化并克隆了四膜虫的端粒酶RNA亚基。另一个谜底揭开了：RNA亚基有一段RNA序列正好和四