[文学]5-PCR原理及分子标记.pptVIP

DNA解旋解链 引物结合 子链延长 PCR的应用 基础研究方面的应用 在医学方面的应用 （1）在基础研究方面的应用 1.扩增目的基因和检定重组子 2.特定片段的获得及其克隆 3.基因功能和表达调控研究（检测基因表达） 4.引入定点突变，微小缺失或插入 5.从少量mRNA制备cDNA文库 6.染色体步查 (基因组测序) 7. 制备单链模板 ８．进化分析 ９．序列分析 １０．性别控制 １１．转基因检测 １２．分析生物学证据 在医学方面的应用 限制性片段长度多态性（RFLP）连续分析 根据特异性的扩增带判断遗传病 PCR结合特异性寡核苷酸探针进行诊断 在肿瘤研究中的应用 检测病原体 ??在基因分型中的应用 法医物证检测 优点: 数量丰富、信息量大； 与生长发育无关，取材不受限制； 较多共显性，信息量完整 在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约 Applications 种质资源研究 品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定） 构建遗传连锁图 基因定位（QTL） 标记辅助选择 比较基因组研究 基因克隆（图位克隆） 生物起源、进化、医学及法医学 三个步骤 (1)DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； (2) 扩增反应； (3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离 SSR（ Simple sequence Repeat ） =(microsatellite) =(Short Tandem Repeat,STR) Satellite DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。 Microsatellite DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。 继RFLP之后的第二代分子标记 多态性好、重复好、共显性标记 特点 微卫星DNA广泛存在：人和动物（TG）n， 植物（AT）n 微卫星DNA长度的多态性 微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列 原理 根据两端序列的保守性，设计引物；进行 PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序 列多态性。 SSR标记的特点 SSR标记的缺点 进行SSR标记的开发应用时，必须首先克隆微卫星位点，得到微卫星两端的侧翼序列用于设计引物，给SSR的开发应用带来一定困难。 引物设计费时、耗资。各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。 其他 简单序列重复区间（Inter-simple Sequence Repeat, ISSR) 序列标记位点（Sequence-Tagged Sites,STS) 小卫星DNA（Minisatellite DNA) 单链构型多态性（Single-strand Comformation Polymorphism,SSCP) 变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE) 扩增共有序列遗传标记（Amplifiied consensus genetic markers,ACGM) 分子标记的应用 分子标记遗传图谱的构建和基因定位 分子标记对质量性状的基因定位 数量性状基因位点（QTL）分子标记对定位的研究 分子标记辅助选择育种 亲缘关系分析 分子标记用于种质鉴定的研究 良种登记、系谱记录的建立及亲缘关系鉴定 品种或品系遗传纯度的测定及遗传关系确定 物理图谱：是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。 遗传图谱：某一物种的染色体图谱（连锁图谱），显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置，而不是在每条染色体上特殊的物理位置 分子标记遗传图谱的构建和基因定位 质量性状基因定位 QTL定位 再 见 SSR标记呈共显性的孟德尔遗传 SSR多态性强，微卫星DNA本身重复单位数的变异是形成微卫星位点多态性的基础 SSR随机均匀分布于整个基因组中，不同物种变化很大 水稻1000个 拟南芥350个 玉米12000个 (AC)n 小麦 (AC)n/ 292kb (AG)n/212kb SSR以PCR技术原理为基础，易掌握，引物序列公开发表，易传播使用 (1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高； (2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高； (3)以孟德尔方式遗传，呈共显性； (4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合