[理学]3 引物设计及测序结果分析.pptVIP

第三章 引物设计及测序结果分析 引物设计流程：1)序列查找下载；2）序列同源性比较；3）引物设计与筛选；4）加工修饰；5）评价分析；6）二次筛选；7）最终评估 引物设计原则 引物设计软件 引物设计流程： 引物设计原则：互补；避免二聚体和发夹；避免错配。 引物设计软件 【3】引物设计与筛选 软件：Primer Premier 5.0 引物：扩增BPMV CP基因片段 【4】引物加工与修饰 5【引物的评价与分析】 实例分析：仅知道表达蛋白序列而DNA序列未知 对BPMV病毒短肽设计简并引物 用BLASTP查询短肽的同源序列 获得BPMV密码子使用频率表 引物设计：氮端氨基酸MFASFIFSG对应的核苷酸序列（p55) ATG TT(T/C) GC(A/T/C/G) (T/A)(C/G)(A/T/C/G) TT(T/C) AT(T/C/A) TT(T/C) (T/A)(C/G)(A/T/C/G) GG 实例分析：利用其它生物的序列获得基因（扩增HMGR) 查找氨基酸序列 不同氨基酸序列比对 确定保守区域 利用引物设计软件设计引物 专业软件进行评价引物 简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。 核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号外还出现如R、Y、M、K等其它字母（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W= A/T，H= A/C/T，B= C/G/T，V=A/C/G， D=A/G /T,N=A/C/G/T）。 3.2 测序结果分析 3.3 序列拼接 一次测序只能保证800bp左右的片段测准，所以如果获得大片段PCR产物的序列，或某基因组序列，需要利用测序重叠部分进行组装。 DNAMAN软件启动界面 上机前的准备 仔细通读教材 下载涉及的软件 相关资料数据 参考本章课件 swxswxxx@ 2012.0306 【6、7】引物的二次筛选和最终评估 排除和基因组其他序列高度相似的引物。引物连续10bp以上，或其3’端连续5-6个序列相同。这样的引物要排除。 用NCBI的BLAST程序寻找可能存在的同源序列（相似）。 PCR实验，得到的产物进行测序。 实例分析： Primer-BLAST工具 3.1.3简并引物设计 简并（Degeneracy） 简并引物是多种引物的混合体 简并PCR 设计原则：长度、模板区域、密码子偏好、引物终止的碱基选择、次黄嘌呤的应用 * 3.1.2常规PCR引物设计实例分析 使用BLAST、Primer Premier、Oligo设计引物 BPMV，CP（coat protein) 设计CP 引物 【序列查找和下载】 序列同源比较 *