表达传染性喉气管炎病毒gB主要抗原表位区域重组新城疫病毒的构建教案.ppt

Confidential Copyright ? 2008 by HuaAT  表达传染性喉气管炎病毒gB主要抗原表位区域重组新城疫病毒的构建 中国预防兽医学报 2015年6月 * 目录 摘要 背景介绍 材料方法 结果 1 2 3 4 5 讨论 * 摘 要 为构建以新城疫病毒(NDV)为活病毒载体表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB主要抗原表住区域的重组病毒,本研究以ILTV LJS09株的DNA为模板，通过PCR技术扩增1323bp ILTV编码gB主要抗原表位的基因片段(1 bp～440 bp)，将其插入到NDV感染性克隆pBR-FL中,构建含有ILTV gB主要抗原基因的NDV cDNA克隆pBR-FL-gB1-440。利用磷酸钙转染法，在辅助质粒pcI-neo-NP、pcI-neo-P和pcI-neo-L的共同作用下,将重组质粒转染于表达T7聚合酶重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞，获得重组病毒rL-gB1-440。 * 采用RT-PCR检测接种重组病毒的鸡胚尿囊液，结果表明重组病毒中含有相应的外源基因。利用gB的抗血清检测重组病毒中gB的表达，间接免疫荧光试验表明，在感染重组病毒的BSR-T7/5细胞中目的蛋白得到表达。本研究为研制和开发传染性喉气管炎重组新城疫二联活疫苗奠定基础。 摘 要 * gB蛋白 糖蛋白gB是ILTV主要的囊膜糖蛋白，由883个氨基酸组成。gB对病毒的吸附、穿入及细胞间传播具有重要作用。此外，该蛋白能够诱导机体产生有效的免疫反应，属于ILTV的主要保护性抗原 * NDV作为病毒载体应用优点 1、NDV具有不分节段单股负链RNA，遗传相对稳定，仅有一个血清型，病毒株间发生重组 及毒力返强可能性很小 2、由于NDV复制过程为RNA到RNA，并在胞浆内完，不存在DNA阶段及与细胞基因组整合的可能 3、NDV疫苗可以同时诱导体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式进行免疫 4、NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成品低 * 背景介绍 鸡传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒引起的一种急性、接触性上部呼吸道传染病。其特征是呼吸困难、咳嗽和咳出含有血样的渗出物。剖检时可见喉部、气管粘膜肿胀、出血和糜烂。在病的早期患部细胞可形成核内包涵体。本病1925年在美国首次报道后，现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，危害养鸡业的发展。 * 鼻窦肿胀，腔内有粘液 喉头肿胀，气管内的血痰 * 主要实验材料 1、ILTV LJS09 2、表达T7聚合酶的重组痘病毒VTF-3 3、NDV 感染性克隆pBR-FL 4、稳定表达T7聚合酶的BSR—T7／5细胞系、 LMH细胞系 5、 表达辅助核蛋白(pcI-neo-NP)、磷蛋 白(pcI-neo-P)和大聚合酶蛋白(pCI-neo-L)的重组质粒 6、 抗ILTV gB的多抗血 7、9日 龄sPF鸡胚 * 构建PBR-FL-gB1-400重组质粒 扩增gB目的基因 引物设计 构建PBR-FL质粒 转染 RT-PCR 间接免疫荧光实验 技术路线 * 实验方法 引物设计与合成 根据GenBank中登录的ILTV LJS09基因序列设计用于扩增gB主要抗原表位区基因的引物Pl/P2，序列为：5-GCGTTTAAACttagaaaaaaTacggagaaCgccaccATGCAATCCTACATCGCCGTGAACATTGAC-3’ 5CGGTTTAAACTTTAGCTTGGCGACGCTCTCTCCcTCTCGG-3’.引物加下 划线部分为引入的Pme I酶切位点，小写字母分别 为加入的基因终止信号和基因起始信号，小写斜体部分表Kozark序列。 * 目的基因的扩增及感染性cDNA克隆的构建 用DNA提取试剂盒提取感染ILTV LJS09的LMH 细胞的病毒DNA，以提取的ILTV LJS09基因组 DNA为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增。反应 条件：PCR产物经1％凝胶电泳检测，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR 产物，得到的目的片段命名为gB1-400。将gB1-400片段 进行Pme I酶切，回收纯化gB1-400基因片段克隆于经Pme I酶切的NDV感染性克隆pBR-FL中，构建 含有gB1-400基因的NDV感染性克隆,通过PCR验证，筛选出正向连接的阳性重组质粒，命名为 PBR-FL-gB1-400 * 重组病毒的拯救 将痘病毒VTF-3感染生长至50％～80％的BSR-T7/5胞．参照磷酸钙转染试 剂说