几种常用生物活性测试方法简介PPT.pptx

几种常用生物活性测试方法简介;;等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。;受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。;Isothermal Titration Calorimetry (ITC);ITC独特之处： 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。;surface plasmon resonance , SPR;surface plasmon resonance , SPR;surface plasmon resonance , SPR;分子水平活性测试方法;Time-resolved fluorescence energy transfer?(TR-FRET)?;镧系元素（铕Eu和铽Tb）半衰期长(us-ms)，将Eu纳入立体笼中，形成稳固复合体，笼收集光将能量转移到Eu上。;Time-resolved fluorescence energy transfer?(TR-FRET)?;General Format For FRET ;1.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer分别将成分Eu-labeled donor 和 dye-labeled acceptor (带straptavidin标记）?100倍稀释； 2.向384孔板中，每孔加入稀释好的Eu-labeled donor 和dye-labeled acceptor 各2.5ul； 3.向每孔中加入一定量的化合物，阳性对照组加入对应体积的DMSO；振荡反应1min； 4 .根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分BET Bromodomain 40倍稀释。分别向化合物检测组和阳性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 5.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分acetylated Ligand1（带Biotin标记） 40倍稀释。向阴性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 6. 每??加入一定量的BRD4 bromodomain ，保证每个反应体系中含有4.5ng含量的酶。 7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。;enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);双抗夹心法（Sandwich ELISA）;enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);1. Integrin?α6β1蛋白?5μg/ml，50μl/孔，4oC固定过夜；（包被 Coating）2. PBS?250μl/孔?冲洗3次；（封闭 Blocking）3. 加入上述多肽，其中CRWY-biotin?工作浓度为0.00005mol/L，体积为50μl。阻断肽为0.0005mol/L，50μl；4. 室温结合1小时；5. HEPES冲洗6次，250μl/次；6. 加入HRP- straptavidin?1：3000，室温1小时；7. HEPES冲洗6次，250μl/次；8. 加入50μl?TMB，观察显色效果；9. 加入100μl?0.5M?H2SO4终止反应，450nm测OD值。;;检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用于检测细胞增殖、细胞毒性。;MTT;MTT的缺点： 由于MTT经还原