[理学]现代分子生物学.ppt

第五章 PCR技术及其应用 §1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用 国内复旦大学 1988 年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在 1989 年研制成功了 PCR 自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC51A/B 型 DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。 PCR 发明不到 10 年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章 发表。1991 年，期刊“PCR 方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR 技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。 1993 年度诺贝尔化学将已于 10 月 13 日揭晓，Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得此殊荣。现在世界各地都在使用 PCR 检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。瑞典皇家科学院说：“PCR 方法已经广泛应用于生物医学中。该方法同 DNA 测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”一名加拿大籍英国科学家Michael Smith 因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与 Mullis 同享此荣。 二、PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR产物的积累规律 在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。 五、PCR引物的设计一般原则 ①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 ②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 ③G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 ④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。 ⑤引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。 ⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 ⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 六、PCR中应注意的事项 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照