病毒的接种病毒和感染的血清学诊断.ppt

病毒的接种 和病毒感染的血清学诊断 参考《微生物学》 了解 病毒的培养方法 掌握 病毒的鸡胚绒毛尿囊膜接种法及小鼠脑内接种方法。 概述 病毒结构简单，缺乏完整的酶系统，不能在无生命的人工培养基中生长，必须在活的组织细胞中才能增殖。 一、动物接种 动物接种（Animal inoculation）是最早应用的病毒培养法，在病毒学研究中主要有三方面用途：分离鉴定病毒、通过传代增殖或减弱病毒毒力、制备免疫血清。在分离病毒时由于动物自身可能带有病毒，而且许多病毒没有敏感动物，因而目前多被组织培养所代替。 常用的动物有小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、家兔、羊和猴等。接种的途径有鼻内、皮内、脑内、腹腔内和静脉注射等。 （一）小鼠脑内接种 1、以无菌0.25ml注射器抽取流行性乙型脑炎病毒悬液0.1ml，去除注射器内的气泡。 2、取出小鼠，左手将小鼠固定（固定时用大拇指和食指握住小鼠的头部，左手手掌轻轻按住小鼠的体部）。 3、右手用棉签蘸以碘酒，消毒小鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。 4、右手拿注射器在小鼠颞部（眼与耳根联线的中点略偏耳朵的方向）注入，进入颅腔即可（一般进针2－3mm），不要插得太深，注射量为0.02－0.03ml。 5、注射完毕，将用过的注射器放入煮沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。 （二）鸡胚接种 接种途径 可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离流感病毒常用羊水囊和尿囊同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法 判断鸡胚是否存活 ⑴ 在检卵灯下观察能否看到清晰的血管； ⑵ 胚胎是否移动； ⑶ 若胚龄过长，则需观察其胎盘部分，胎盘部分变苍白说明胚胎死亡，正常时胎盘发暗，蛋白部分透亮。 绒毛尿囊膜接种法 定位：将胎盘部分及自然气室部分用铅笔画出，在胎盘与蛋白交界处（无血管区）画一直径约1cm的等边三角形。 取卵壳：消毒后取下所画三角形区域的卵壳，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺一小口（不要伤及绒毛尿囊膜）， 造人工气室：在自然气室部分用大注射器针头钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一“人工气室” 接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒0.1~0.2ml。 封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。 培养：放入温箱培育4天，然后收获病毒。 真菌菌落的观察（示教） 真菌培养营养要求不高，在一般培养基上能生长 常用沙保弱（Sabouraud）培养基（含4%葡萄糖、10%蛋白胨、琼脂），真菌的最适酸碱度是pH4.0~6.0，最适生长温度浅部真菌22~28℃，深部真菌37℃ 。 真菌菌落类型 酵母型菌落（yeast colony） 菌落光滑、湿润。无菌丝 隐球菌菌落 类酵母型菌落（yeast-like colony） 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 丝状型菌落（filamentous colony） 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落 新型隐球菌：菌落属酵母型菌落，圆形、较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑，与一般细菌菌落相似。 白色念珠菌：菌落属类酵母样菌落，圆形、较大、白色、菌落底层有假菌丝长入培养基内。 絮状表皮癣菌：菌落属丝状菌落，在沙保琼脂斜面培养基上菌落开始为白色，颗粒状，以后变为绒毛样甚至粉末状，有许多辐射状沟，呈草绿色，且培养基常有皱裂。 石膏样小孢子菌：菌落属丝状菌落，在沙保培养基上菌落为棉絮状、羊毛状或粉末状。 注意事项 消毒小白鼠时不要碰到眼睛 注射时不要扎的太深以免刺伤对侧手指 磨卵壳及钻孔时力量要适中 看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中 三、病毒感染的血清学诊断 原理是用已知病毒抗原来检测病人血清中有无相应抗体，故须待病人感染后体内产生抗体时才能检出。 另外，在采取临床标本及病人血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清 (双份血清) 进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊断意义。 1.中和试验(neutralizing test,NT test) 是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。 中和抗体(netralizing antibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原 (衣壳或包膜) 的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。 2.补体结合试验 (complement fixation test,CF test) 用已知病毒可溶性(CF)抗原来检测