蛋白质工程概论.pptVIP

蛋白质工程概论;前言;二、蛋白质工程的基础;（一）工、农业以及医药卫生事业的高速发展 为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景;妨碍酶开发利用的原因主要有： 生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋白成本太高； 酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低； 酶催化活性的最适pH值及底物专一性的范围较窄，与工业应用的要求有较大差距。 因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工业应用的需求，这就需要利用蛋白质工程对蛋白质进行改造。 ;2.在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的基础与应用研究中，同样存在着蛋白质结构的改造问题 如白细胞介素-2（IL-2）是一种免疫反应调节因子，在医学上具有广泛的用途。结构研究证明，IL-2是由133个氨基酸残基组成的多肽，有3个半胱氨酸，1个二硫键，而125位上的半胱氨酸处于游离状态，在分离纯化IL-2的过程中，易发生二硫键错配，致使整个多肽活性降低。 定点诱变将编码链上编码125位半胱氨酸的密码子TGT转换成丝氨酸或丙氨酸的密码(TCT或GCA)，结果可以避免二硫键的错配，使产品IL-2的活性提高了7倍。;再如:单克隆抗体是很有希望的疾病治疗用药,但是,单克隆抗体技术建立起已有数十年,并早已认识到其药用价值,但至今应用不佳,原因是鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源化改造需蛋白质工程才能完成。 ;（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据;;;2．蛋白质动力学 线性多肽是如何折叠成具有三维特征的天然结构？蛋白质在与其他物质（蛋白质、核酸或酶的底物等）相互作用时，其三维结构又是经历怎样的动态过程而发挥其活性？只有了解这些问题，才能预测基因水平的改造最终会对蛋白质结构与功能产生何种后果，才能谈得上具有真正意义的分子设计，才能真正的理解生命现象。蛋白质动力学正是研究这一课题的。 ;3.生物信息学 生物信息学的神速发展为蛋白质动力学的研究提供了方便有效的技术。 生物信息学是利用计算机控制的图像显示系统，把所要研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上，分析哪些残基对分子内相互作用可能是重要的，哪些残基对分子间相互作用可能是重要的。前者通常为结构的稳定所必需，后者多系分子识别及活性重要部位。 然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团，再用计算机寻找经过“微扰”后蛋白质分子的能量趋于极小的状态，预测由于这种替换可能造成的后果。;（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段;2.定点诱变技术的建立为改造蛋白质的特性提供了技术策略 稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如肽键、氢键、静电作用、疏水残基间的疏水键以及二硫键等。 研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。 ;如野生型枯草杆菌蛋白酶的218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将其变成丝氨酸(Ser)，用65℃的失活半衰期衡量，从59分钟增到223分钟，酶的稳定性显著增加。 再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。 枯草杆菌蛋白酶在少量H2O2作用下很快失活是由于埋藏在催化部位Ser221邻近的Met222氧化成硫氢化物的原因。 1985年Wells证明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化活性。;所谓基因定点诱变（site-directed mutagenesis），就是在DNA水平上，在体外试管中通过碱基取代、插入或缺失改变基因DNA序列中任何一个（或几个）特定的碱基，使蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸编码顺序加以改变，从而改变蛋白质结构的技术。;定点诱变原理示意图;三、蛋白质工程的基本程序; 蛋白质工程的程序 分离纯化0.1~1.0mg纯蛋白质， 测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针; 以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体M13系统，用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析; 通过表达载体获得较大量(0.1~1.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案; 通过寡核苷酸M13系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化多量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子。;现阶段蛋白质工程急待解决的一??主要问题是发展克隆基因的表达方法，即找到理想的宿主表达系统。目前常用的表达系统有细菌