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中国药典2005版微生物限度 检查法增修定内容 苏德模; 中国药典2005版微生物限度检查法在检查项目、格式、语言表述等方面都有较多的增定和修订。 增订中主要的有四项：一是三菌数测定的方法验证；二是控制菌检查的方法验证；三是大肠菌群检查法；四是梭菌检查法。 前言 增订 ●微生物限度检查在环境的洁净度10000级和局部100级的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法》现行标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 ;●气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冷冻室冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温，并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液），使匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。 ; 具抑菌活性的供试品 当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。常用的方法有： ①培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级2ml供试液等量分注多个平皿，按浇碟法操作，培养、计数。每1ml供试液所注各平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数，取平均菌落数乘以稀释倍数的值按菌数报告规则报告菌数。 控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 ;②离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，3000转/分离心20min（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5min，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。 ③薄膜过滤法 采用开放式薄膜过滤器。 ④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释剂或培养基中。 ;细菌、霉菌及酵母菌计数 增订 计数方法的验证 对药品进行微生物限度检查法时，首先应进 行检测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌 计数方法的验证，以确认该计数方法是否科 学、准确、客观（产品质量）。若供试品的 组分或原检验 条件发生改变可能影响检验 结果时，计数方 法应重新验证。验证时，按供试液的制备， 细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法及下 列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进 行验证。 ; 验证用菌株及菌液的制备 菌株（代表性） 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉菌。 菌液制备（菌种传代、保存及使用5代） 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1ml含50~100cfu的菌液。 （黑曲霉菌液制备、比浊法计数） ; 验证方法 试验组 取规定量最低稀释级的供试液1ml，和50~100cfu试验菌，每株菌做2个平板，按平板菌落计数方法测定其菌数。采用薄膜过滤法计数时，最后一次冲洗液中加入50-100cfu，过滤，培养，计数。 菌液组 测定加入的试验菌液的菌数。 供试品对照组 取规定量的供试液，按平板法测定供试品稀释液本底的菌数。 稀释剂对照组 取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每1ml 供试液含50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。 ; 试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数–供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 ]×100% 稀释剂对照组的菌回收率=[（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）]×100% 结果判断 在三次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌和酵母菌数；若任一次平行试验中试验组的菌回收率均小于70%，不符号验证试验，应采用培养基稀释法、离心集菌法、过滤法、中和法等方