方法学评价与试剂盒评价实验.DOC

第六章 方法学评价与试剂盒评价实验 临床生化方法学评价与试剂盒质量评价是通过实验的途径客观评价实验方法及其试剂分析性能的重要手段。通过评价实验的教学，在让学生正确掌握方法学评价和试剂盒评价实验的设计原理和基本方法，增强方法优选意识，为正确选择、评价和改进临床生化方法及其试剂盒，培养学生具有初步科研的能力，开拓创新等方面打好坚实的基础具有重要意义。 本章选用血糖测定项目，评价方法为葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)及其试剂盒，比较方法采用血糖测定的参考方法已糖激酶法(HK法)。目前，两法均有试剂盒供应临床使用。 第一节 方法学评价试验 GOD-POD法和HK法在方法学上的最大差异在于两者测血糖的特异性不同。GOD-POD法第一步反应相当特异，GOD仅作用于β-D葡萄糖，此时如果用氧电极来测定氧的消耗速率，此法第一步反应即完成，特异性很高，但目前为临床方便常将过氧化物酶(POD)与之相偶联，测定GOD氧化葡萄糖生成的H2O2，此法存在两个问题：①由于POD特异性较差，可作用于血中其它过氧化物，使结果偏高；②H2O2是强氧化剂，标本中共存的维生素C、尿酸等能使其还原，干扰测定结果，尤其在临床用药和高尿酸血症时特别敏感。HK法的第一步反应由于HK特异性较低，不仅作用于葡萄糖，也作用于其它单糖生成相应的6-磷酸衍生物，但与它相偶联的指示酶葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)是特异性很高的酶，和其它单糖-6-磷酸无作用，仅选择性地作用葡萄糖6-磷酸(G-6-P)，结果十分准确。 由此可见，HK法优于GOD-POD法，HK法被国际公认为参考方法，GOD-POD法只能用作临床常规检测方法，评价方法和比较方法以及相应的试剂盒组成见本章后附录。 实验27 线性范围试验 在光谱分析中，测定该实验条件下被测物质符合Beer定律的浓度范围(线性范围)，是评价分析方法准确性和实用性的重要工作。通过线性范围测定，选择线性段作为该方法的分析范围，直线上任何一点的待测物浓度与吸光度的比值均为一常数，其斜率tanθ都相等，即 tanθ=， 此处的值称为校正常数，可用于计算测定结果。这样，可使具有临床意义的标本测定值都限定在此范围内，以保证测定结果的可靠。 线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。这种偏离，按Beer定律现象来自两个方面：一是溶液本身不符合Beer定律，这种现象叫做化学偏离；二是仪器本身各种因素的影响，使吸光度与浓度之间不成线性，这种现象叫仪器偏离，如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件的变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的非平行性、检测器本身的非线性等。因此，在做方法学线性范围评价实验时，良好的仪器性能是必须的。 【原理】 使用不同浓度的葡萄糖标准溶液，用GOD-POD法试剂测定各自的吸光度，以标准浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，在方格纸上作图，即可绘制出一条直线，即剂量反应曲线(dose-respones curve)。一般测定方法的线性范围要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。 【试剂】 1．40mmol/L葡萄糖标准溶液 称取已干燥恒重的无水葡萄糖0.7208g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h后方可应用。 2．其它试剂 同GOD-POD法试剂。 【操作步骤】 按表6-1操作 表6-1 血糖与GOD-POD试剂剂量反应曲线的制作 加入物 标 准 管 0 1 2 3 4 5 葡萄糖标准液(μl) 0 2 4 6 8 10 蒸馏水(μl) 10 8 6 4 2 0 GOD-POD试剂(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 下同GOD-POD法，读取各管吸光度。 以葡萄糖浓度(mmol/L)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，将其交点在方格纸上标出，即可获得血糖与GOD-POD试剂的剂量反应曲线。 【注意事项】 1．葡葡糖标准液的加量必须十分准确，应用计量性能准确度很高的微量进样器加样。 2．标准管系列中每管平行作3管取平均值。 3．本方法的线性可达22.24mmol/L，造成线性变窄的原因为试剂配制中组分投料不足；试剂配制后组分稳定性差；因运输、贮存不当等导致试剂组分的含量发生变化。 4．有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指定的高限，但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这往往是样品中的介质效应引起的，值得注意。 【线性范围的确定及其评价】 1．测定上限 测定上限应使95%的临床标本不经稀释