[医药卫生]肿瘤相关基因突变的临床意义及其检测方法.pdf

肿瘤相关基因突变的临床 肿瘤相关基因突变的临床 意义及其检测方法 意义及其检测方法 中山大学肿瘤防治中心 中山大学肿瘤防治中心 分子诊断科 王芳 分子诊断科 王芳 一、核酸DNA提取 二、基因突变常规检测手段 基因突变常规检测手段 三、肿瘤相关基因突变简介 三、肿瘤相关基因突变简介 四、核酸扩增技术其他用途 五、新基因介绍 五、新基因介绍 第一部分 基因组DNA提取方法 硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸 磁珠法：独特包埋的磁珠 传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低 RNA提取方法 硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸 TRIZON ：一步法 样本种类 血液学样本：抗凝血液、血浆、血清、全血、骨髓 组织学样本：新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织 脱落细胞：胸腹水、痰液、宫颈诊刮LCT、TCT 石蜡组织基因组DNA提取流程 硅胶膜吸附法（吸附柱法） 样本裂解 加入吸附柱 缓冲液漂洗 DNA洗脱收集 核酸保存 • 浓度：100－300ng/ul • 纯度：避免杂质导致DNA在储存过程中的降解 • 温度：分装-20℃保存 • 溶解DNA Buffer ：TB Buffer 或者Tris缓冲液 DNA检测方法－紫外分光光度法 纯度（ OD260-320 /OD280-320 ） 紫外分光光度计测量 • 选择稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间： • OD260 /OD280 1.7 有蛋白的污染 OD260 /OD280＝1.7～1.9 纯度很好 OD260 /OD280 1.9 部分降解或有RNA污染 DNA检测方法－内参检测法 石蜡包埋组织GAPDH扩增产物电泳图 第二部分 基因突变检测方法 显微切割 + 直接测序 直接测序法 荧光定量PCR法 Mutation-riched PCR PCR-SSCP …… 激光捕获显微切割 （laster capture microdissection, LCM） 工作原理： 利用紫外激光对生物样本进行 切割和分离，通过弹射装置将目 的细胞收集于EP管内。 功 能： 通过从诊断明确的组织中切取 切割之前的目的癌巢 获得的细胞或细胞成份，提取核 酸，可用于PCR、DHPLC等 切割之后，可见目的癌 巢已取走 直接测序法 原理：双脱氧终止法