[理学]酶工程 第五章 酶的化学工程08级.ppt

复习 盐析与盐溶 膜分离 离子交换层析 凝胶层析 胶束与反胶束 第五章 化学酶工程 酶的分子工程分类 1、分子生物学水平： 用基因工程方法对DNA进行分子改造，以获得化学结构（一级结构和空间结构）更合理的酶蛋白； 2、蛋白质水平： 对天然酶分子进行改造，这包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等。 酶的分子工程基本内容 1、酶分子改造：对酶蛋白的主链“切割”，即根据酶的结构与功能的研究，通过一种相应的方法，去掉酶分子那些与活性无关而有碍应用的部分，提高其活性，增加稳定性。（酶基因工程） 2、酶分子模拟：根据酶作用原理的研究，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成的方法制备高效、专一、分子较简单、较稳定的新型催化剂。（模拟酶、印迹酶） 3、酶的化学修饰：即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶的酶学性质的技术。 第一节 酶分子的化学修饰 Modification of Enzyme Molecule 主要内容 *酶进行分子修饰的原因 *酶化学修饰的基本原理 影响酶蛋白功能基反应性的因素 酶化学修饰方法 修饰酶的性质特征 酶进行分子修饰的原因： （1）稳定性（受蛋白酶水解） （2）作用的最适条件（pH中性、室温、溶液状态） （3）酶的主要动力学性质的不适应（ Km值大，与底物的亲和力小） （4）临床应用的特殊要求（抗原性） 一、酶化学修饰的定义 广义：凡涉及共价或部分共价键（covalent bond）的形成或破坏的转变，从而改变酶的酶学性质都可称为酶分子的化学修饰。 狭义：在较温和的条件下，以可以控制的方式使酶同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基发生共价的化学改变。 二、酶化学修饰的目的 （1）改变活性部位的构象 （2）提高生物活性 （3）增强酶的稳定性 （4）降低酶类药物的抗原性 （5）改变酶学性质 三、酶化学修饰的基本原理 （一） 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 酶是具有催化活性的蛋白质，其多肽链通过一定的方式互相折叠形成了高级结构即天然构象。这种天然构象的稳定性与酶分子上许多基团间相互作用所产生的能量（焓）和酶分子的无序程度（熵）有关。 酶催化功能的发挥需要这种高度有序的天然构象来保证。如果从热力学角度看，酶天然构象高度有序，熵值小，应该说是不稳定的，但是酶分子结构中内部基团间的相互作用、基团与外相水溶液间的相互作用，能产生补偿性的焓值和熵值，使整个酶分子结构的熵值最后处于一种平衡状态，紧密有序的构象得以维持。 当酶发生热失活时，主要是因为酶分子内基团间的相互作用在受热情况下发生了变化，原先的平衡力受到了破坏，于是酶分子天然构象就向热力学上熵值高方向变化，即从紧密有序趋于随机松散，折叠结构打开，最终导致了酶催化功能的丧失。 酶化学修饰则是基于，从增强酶天然构象的稳定性着手来减少酶热失活。酶化学修饰通过酶与修饰剂交联后，就可能使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，并同时减小酶分子内部基团的热振动，从而增强酶的热稳定性。 （二）如何保护酶活性部位与抗抑制剂 酶一般是大分子物质，而发挥催化功能的活性部位只是整个酶分子结构中的一部分。酶活性部位包括与维持活性部位稳定性有关的基团的任何变化都会影响到酶的催化功能。 抑制剂与酶的结合部位 酶经过化学修饰共价交联上大分子修饰剂后，大分子修饰剂所产生的空间障碍或静电斥力就可能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护酶活性部位，使抑制剂或酶活性部位结合的难度增加，使酶的抗抑制剂能力增强。 （三）如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶本身也可能成为另一种酶（如蛋白水解酶）的底物。对于蛋白水解酶来讲，一般是作用于某些特定敏感键后，导致蛋白多肽链断裂。 根据蛋白水解酶是一大分子物质，并只是在充分接近多肽链上敏感键和敏感基团后才能产生作用的原理，酶化学修饰期望交联于酶上的大分子修饰剂能产生空间障碍来阻挡蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。另外，酶分子上许多敏感基团（如赖氨酸的ε－氨基等）参与修饰反应，交联上修饰剂后，也减少了酶分子遭受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。 （四）如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 酶分子结构上有一些氨基酸残基组成了抗原决定簇，当酶作为异源蛋白进入机体后，就会诱发产生抗体，抗原-抗体反应不但能使酶失活，且会对人体造成伤害及危险。 通过酶化学修饰，有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，这样就可能破坏了酶分子上抗原决定簇的结构，使酶的抗原性降低乃至消除。同时，大分子修饰剂也同样能“遮盖”抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。 四、酶化学修饰的方法学 基本原