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[生物学]蛋白质分离与纯化
* * * * * * 說明文字 * * * * 早在1886年,两位生理学家G.Mering和O.Minkowski为了研究胰脏的消化作用,将狗的胰脏用外科手术切除,结果狗的尿量大增,并于10d~30d之内死去。他们同时还发现,切除胰脏后,狗排出的尿招引了许多蚂蚁,而正常狗的尿不招引蚂蚁。分析狗尿,发现切除胰脏的狗尿中含糖很多。 由于手术后狗出现的症状和人的糖尿病症状很相似,他们推想,人糖尿病的病因可能是胰脏出现了问题。由于他们这一偶然的发现,人们的注意力就被引向胰脏与糖尿病的关系上去了。 是胰脏的哪一部分与糖尿病有关呢?胰脏有一个特点,即结扎胰液管后,胰脏的有管腺部分就逐渐萎缩而失去功能,但胰岛不萎缩。据此人们做了结扎胰液管的实验,结果表明,结扎胰液管的狗不发糖尿病。由此可知,胰脏的有管腺部分与糖尿病无关,因而糖尿病可能是由于胰岛发生病变而引起的。1922年,加拿大多伦多大学的F.G.Banting和C.H.Best将狗的胰液管结扎,待胰脏萎缩,只剩胰岛保持正常时,将萎缩胰脏取出,用等渗盐水制成滤液,将滤液注射给切除胰脏的狗,结果狗不出现糖尿病症状;而胰脏被切除,但未接受注射的狗则发生糖尿病。用胚胎时期的胰脏(已有胰岛,但有管腺部分尚未长成)制成提取液注射,可得到相同的效果。由此可见,胰岛中,而不是胰脏的有管腺部分中,含有防止糖尿病的物质,即胰岛素。 1926年,美国J.J.Abel提纯胰岛素,得到胰岛素结晶。1954年,F.S.Anger和他的同事测出了胰岛素分子的氨基酸序列,使胰岛素成为第一个确定了氨基酸序列的蛋白质。胰岛素含有两条肽链 * * 蛋白质一级结构测定,详细 * * * DNP: 二硝基酚衍生物 * * * * * 說明文字 * * 說明文字 决 定 N 端 氨 基 酸 只有 N-端氨基酸 会被丹磺酰氯修饰 HCl hydrolysis TLC plate 2D chromatogram 氨基酸水解液 以紫外线显色 N-terminal TLC TLE N末端分析 3:Edman降解法 蛋白质N端的氨基酸与异硫氰酸苯酯 (PITC)反应,并一个一个按顺序切下,生成易于检测的苯氨基硫甲酰 (PTH) 氨基酸,利用液相色谱进行分析,从而测定蛋白质的氨基酸序列。 目前应用最广泛 pH 8.7~9.0 40℃ 环化 H+ 水解,氨基酸抽提 苯氨基硫甲酰氨基酸 苯氨基硫甲酰多肽 异硫氰酸苯酯 多肽 + Peptide N- PTH- 1 2 1 PTH- 2 1 2 Amino acid analysis Second cycle 切除N-端氨基酸 的剩余部分 PTH-氨基酸 裂解 Edman degradation + PITC 异硫氰酸苯酯 (PITC) 苯氨基硫甲酰多肽 苯氨基硫甲酰 氨基酸 1. 硼氢化锂还原 生成相应的α氨基醇。肽链水解后,再用层析法鉴定。有断裂干扰。 2. 肼解法 多肽与肼在无水条件下加热,可以断裂所有的肽键,除C末端氨基酸外,其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸,半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 3. 羧肽酶法 在pH8.0, 30℃用羧肽酶处理,定期取样,用纸层析测定释放出来的氨基酸,根据氨基酸的量与时间的关系,就可测出C末端氨基酸的排列顺序。 C末端分析: 羧肽酶是一类肽链外切酶,专一的从肽链的C末端开始逐个降解,释放出游离的氨基酸。被释放的氨基酸数目与种类随反应时间的而变化。根据释放的氨基酸量(摩尔数)与反应时间的关系,便可以知道该肽链的C末端氨基酸序列。 羧肽酶A:水解除精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和脯氨酸(Pro)外所有肽键。 羧肽酶B:水解精氨酸和赖氨酸。 羧肽酶法 以传统氨基酸测序法决定蛋白质序列 N- + PITC (Edman degradation) PTH- 鉴定氨基酸种类 依序排出氨基酸序列 1-2-3-4-5-6--- 由两组序列推出整段 使用两种不同的蛋白质水解酶 每片段 分別测序 Peptide 1.2 利用酶把肽链水解成肽段 水解肽链的方法及特征 天冬酰胺-甘 蛋 (C) 苯丙、色、酪 (N) 丙、甘、丝、缬 (C) 苯丙、酪、色 (C) 赖、精 (C) 裂解位点 羟胺 溴化氰 弹性蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 裂解剂 A 胰蛋白酶作用 B 胰凝乳蛋白酶作用 拼出完整氨基酸序列 精 赖 苯丙 色 A B 将蛋白质水解为氨基酸,测组成 确定N和 C端氨基酸 确定小肽段氨基酸序列 确定小肽段氨基酸序列 利用
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