柱式分离RNA.doc

PureLink? RNA Mini Kit Contents 一、试剂和溶液准备2–mercaptoethanol 100% ethanol 10% SDS (in RNase-free water), 0.5 μl/sample: 配制20ml：称量2g SDS溶于17ml水中，加热到68℃并搅拌有助于溶解，并定量到20 ml。如果需要加几滴浓盐酸有助溶解。 Lysozyme solution, 100 μl/sample: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 10 mg/ml lysozyme (in RNase-Free Water)。 配制100ml溶菌酶10mg/ml: Tris10 Mm)：0.121g(pH 8.0) EDTA（0.1 mM）：20μl 0.5EDTA 溶菌酶（10 mg/ml）：1g Homogenizer or RNase-free syringe (1 ml) with 18-21 gauge needle or rotor-stator homogenizer (see page 8) 6. Lysis Buffer准备： 在开始溶菌和混匀前，准备现配制的Lysis Buffer，含有1%的2-羟基乙醇。 即1ml Lysis Buffer加10ul 2-羟基乙醇，对少于1x109的细菌Lysis Buffer 的用量为350ul. 二、步骤 （一）溶菌和混匀 将0.5ml对数期菌液加入到含2倍体积的RNAprotect Bacteria Reagent（1ml）的无RNAase的离心管中，涡旋5s后，置室温静至5min，4℃，2000g×10min，弃上清，倒置离心管，轻轻拍打，弃去残余液体。 加入50μl的溶菌酶，涡旋重悬细胞沉淀10s，两管菌液集于1管（即1ml菌液加100μl溶菌酶） 加入0.5μl 10%SDS溶液，涡旋混匀。 室温孵育5min。 加入350μl Lysis Buffer(含有1% 2-羟基乙醇)。 剧烈涡旋震荡或用1ml （18-21号针头）注射器反复抽吸5次，室温12000g×2min。并将上清转移至另一干净的RNAase-free的离心管中。 (二)、结合、洗涤、和洗脱 每份体积的细菌上清液（少于1x109）加入250μl 100%乙醇。 加入乙醇后可能形成沉淀，应涡旋充分混匀。 将混合样品（包括仍保留的沉淀）转移至带收集管的离心柱。 室温12000g×15s，弃去流出液，柱子放回收集管。 加入700μl Wash Buffer I，室温12000g ×15s。弃去液体和收集管，将柱子置于新的收集管中。 加入500μl Wash Buffer II（含有乙醇）。 离心12000g,15s,室温。弃去液体，柱子放回收集管。 重复6-7步骤。 室温12000g ×1min，弃去收集管，放柱子于回收管。 加30-100μl RNAase-Free水于柱子中央。 室温孵育1min。 室温12000g ×2min 储存-80度。 【疑难问题】 为何Lysis buffer 加入后出现悬浮物？ 细胞沉淀未完全重悬：以最大速度离心2min,吸上清继续下一步实验。 加了细菌保护剂的细菌离心后的残液未完全去除：反转离心管于纸上，轻拍管子，去除多余的液体。 细菌的数目过多 RNA产量低的原因？ 加入细菌的量不够： 裂解和均质不完全：应剧烈涡旋重悬细胞；所有步骤均在室温；别忘记加10μlβ-巯基乙醇加在1ml Lysis buffer中； 没完全重悬细胞沉渣：将沉淀细菌和保护剂的离心力降低到2000g,但有可能导致不完全的沉淀。 细菌处在对数后期 Wash Buffer II没加乙醇 DNA污染的原因及解决办法？、 未完全裂解菌液或乙醇沉淀前未将沉淀物完全驱散： 方法：DNA酶消化 抑制下游酶切反应？ 乙醇未完全去除干净：Wash Buffer II弃去后最大速度离心柱子2-3min，以干燥柱子。 RNA中残留盐：再次用Wash Buffer II洗涤 准备DNase Mixture 80μl per sample,于Rnase-Free的试管中. 10X DNase I Reaction Buffer 8 μl Resuspended DNase (~3U/μl) 10 μl RNase Free Water 62 μl 加入350 Wash Buffer I 离心12000g,15s,室温。弃去液体和收集管。放置柱子于新收集管中。 加入80μl DNase Mixture 于柱子膜上 室温，15min. 加入350μl Wash Buffer I