PCR-扩增.docVIP

PCR-扩增 一、实验目的 学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法; 深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。 二、实验原理 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR ) 原理 类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 PCR 反应系统的组成 引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。 ??? 三、材料与试剂 PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等　 2X Taq Master Mix; DNA 模板；引物F；引物R；PCR水； 四、实验步骤 PCR反应体系（10ul） 成份 体积 2X Taq Master Mix 4.0 ul 模板DNA 1.5 ul 引物F 0.2 ul 引物R 0.2 ul PCR水 4.1 ul 总反应体系 10 ul PCR条件 94℃变性5min后开始以下循环:（盖子温度升至99℃） 94℃变性反应30 sec；55℃退火反应30 sec；（根据引物确定温度，部分45℃）72℃延伸反应50 sec；进行35个循环；最后72℃反应5min； 16℃保存4℃冷却恒定。 五、PCR产物分析 取3-5ul PCR产物，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。 六、PCR结果??????????????? ????? 浙江师范大学 10-316分子学实验 - 1 -