致病性腊样芽胞杆菌PCR及real-time PCR 检测方法与检测试剂盒的研究.pptVIP

统计资料显示在西欧及北美以腹泻型蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒比较多，而在日本呕吐型蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒比较普遍。 2001年4月26日中午，吉林省辽源市某小学，92人出现食物中毒症状，经当地防疫部门化验证实由蜡样芽胞杆菌污染了所致。 2002年4月18 日，慈利县岩泊渡镇中学76名师生因食用被蜡样芽胞杆菌污染的过夜合渣后发生食物中毒。 2003年6月5日，牡丹江市发生中学生集体食物中毒事件。发病学生20例，经临床、流行病学资料分析及病原学检验，证实这是一起由于食用了被蜡样芽胞杆菌污染的米饭所引起的细菌性食物中毒。 ? 2004年6月17日，赤峰林西县工商局家属楼建筑工地26名湖北籍民工因食用被蜡样芽胞杆菌污染的剩米饭发生食物中毒。 2004年9月13日，邢台市某中学相继有105名学生出现恶心、呕吐、头痛、头晕等症状。对采集的剩余大米饭进行检验分析发现，米饭中蜡样芽胞杆菌菌落为3×106 cfu/g。确诊为蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒事件。 2005年8月，百色市某校发生一起82名学生集体食物中毒的事件，经流行病学特征、实验室化验和食堂现场卫生学调查，结果在剩余米饭样本中检出蜡样芽胞杆菌，菌落数在106个/克以上。 腹泻型蜡样芽胞杆菌的常规检测 腹泻型蜡样芽胞杆菌由于能产生腹泻毒素，通常通过腹泻毒素的有无来判断蜡样芽胞杆菌的类型。目前对腹泻毒素的检测方法主要是基于免疫学的肠毒素检测试剂盒，分别针对溶血素HBL及肠毒素FM来进行检测。有资料表明，采用免疫学方法存在着漏检的情况，易出现假阴性的结果，其确证实验必须进行细胞毒性试验。一些细胞系对腹泻毒素具有较强的敏感性，常用的一般为猴肾细胞或中国仓鼠卵巢细胞系，这种检测方法是将菌体培养液过滤后，将无菌滤液加入到细胞培养液中，观察细胞的变化情况，该方法具有较强的灵敏性，比肠毒素检测试剂盒要灵敏，但这种检测方法需要细胞培养的全套设备，因而显得繁琐复杂，时间较长，至少需要3天的时间。 呕吐型蜡样芽胞杆菌的常规检测 呕吐型蜡样芽胞杆菌主要产生呕吐毒素，呕吐毒素是十二角形的环状肽，其分子量为1.2kDa。其结构与功能与缬氨霉素相似。呕吐毒素的稳定性极强，不能被胰蛋白酶及胃蛋白酶所水解，在pH 2-11的环境中，121℃加热90分钟仍有活性。该蛋白质也被称为空泡因子（vacuolation factor），因为它能使HEp2细胞(人喉癌细胞)的线粒体形成空泡。 目前还没有一个简单可靠的方法检测呕吐毒素，最常用的方法仍然是细胞培养分析法，既HEp2细胞毒性实验法。因为呕吐毒素能使一些细胞系的线粒体空泡化，这种变化可以在光学显微镜下观察到。一般常用的细胞系为HEp2细胞，这种方法检测的灵敏度能够达到每克米饭样品中含有106-107个蜡样芽胞杆菌的水平 。同样该方法也需要细胞培养的程序，操作复杂需要较长的时间。 腹泻型蜡样芽胞杆菌主要致病因子 腹泻型蜡样芽胞杆菌目前发现能产生4种腹泻毒素（溶血素BL，肠毒素T，肠毒素FM，细胞毒素K），编码这四种毒素的基因均已被发现。其中肠毒素FM存在最为普遍，约占分离菌株的86.8%，其次为溶血素BL约占50%，肠毒素T占42.7%。 溶血素BL（HBL）是腹泻型蜡样芽胞杆菌的主要毒素，具有强烈的溶血作用。溶血素BL主要由3种组分构成，其中B由hblA基因编码， L组分由L1，L2两个亚基组成，分别由基因hblC和hblD编码。各种研究结果表明，大约一半左右的蜡样芽胞杆菌均能产生该腹泻毒素。 腹泻型蜡样芽胞杆菌主要致病因子 肠毒素FM主要由3种蛋白亚基组成，具有强的细胞毒性，由entFM 基因编码。资料显示从食物中分离出的蜡样芽胞杆菌菌株96%均含有该基因，而从食物中毒样品中分离出的蜡样芽胞杆菌100%均含有该基因。entFM基因是已知被发现的在蜡样芽胞杆菌中分布最为广泛的肠毒素基因。 肠毒素T由基因bceT编码，具有细胞毒性。 呕吐型蜡样芽胞杆菌主要致病因子 呕吐型蜡样芽胞杆菌主要产生呕吐毒素，由于呕吐毒素的分子量非常小，纯化分离非常困难，故对其了解较少。此外，由于呕吐毒素是蜡样芽胞杆菌的次级代谢产物，由非核糖体多肽合成酶系（ NRPS ）编码合成，故确定其基因非常困难，直到去年，才确定其相关基因。 研究表明，95%的呕吐性食物中毒都与食用了被蜡样芽胞杆菌污染的米饭有关。目前已分离的呕吐毒素菌株都属于H1 血清型。 呕吐蜡样芽胞杆菌NRPS基因的扩增 呕吐蜡样芽胞杆菌NRPS基因的扩增 结 论 蜡样芽胞杆菌食物中毒的诊断，很多是根据流行病学线索和中毒食品检出的蜡样芽胞杆菌105/克作为食物中毒的判断依据，这