[农业]分子实验报告.docVIP

实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 通过CTAB法提取植物基因组DNA是由Murray和Thompson1980) 修改而成的简便方法。CTAB十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下大于0.7M NaCl，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环质粒DNA，即环状质粒DNA的1条链断裂，open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即环状质粒DNA的2条链在同一处发生断裂linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。 核酸分子DNA或RNA由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50μg/mL，ssDNA 33μg/mL和ssRNA 40μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器10、100、1000μL量程各一支、胶带、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 ml EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷Tris)、乙二胺四乙酸EDTA )、CTAB十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠NaCl)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸EDTA ) 、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 配50mL 100mM Tris-Cl pH8.0 5 mL 1M 贮存液 1.4M NaCl 17.5 mL 4M贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2 mL 0.5M贮存液 2% CTAB 需CTAB固体粉末1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇100 μL 70%乙醇 RNaseA 10mg/mL) 0.5×TBE缓冲液工作浓度 45mM Tris-硼酸盐 1mM EDTA 配5×TBE (贮存液1000 mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20 mLpH 8.0) 5. 凝胶加样缓冲液6×) 溴酚蓝 0.25 % 蔗糖 40 % 6. 溴化乙锭EB ) 贮存液 10mg/mL 7. DNA marker 8. 0.1×TE 9. 酚/氯仿1:1，V/V。 【实验步骤】 1. 取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mL EP管