橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2011,44(4):683-690 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.04.004 橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析 曾日中，段翠芳，聂智毅，代龙军，黎 瑜 （中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学重点开放实验室/省部共建国家重点实验室培育基地，海南儋州 571737 ） 摘要：【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库，降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数，提高胶 乳表达基因的分离鉴定和 EST 测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研 7-33-97 的胶乳为材料，将胶乳全长 cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组，构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库，经检测原始文库的 滴度为6.0×106 cfu/mL，平均插入片段长度大于1.5 kb，重组率约为100%，全长cDNA 比例约为76%；利用基因 组 DNA 饱和杂交技术对胶乳原始 cDNA 文库进行均一化处理，构建橡胶树胶乳的均一化全长 cDNA 文库。【结果】 胶乳均一化全长 cDNA 文库的总库容量（总 CFU）为 1.87×105 ，重组率大于 95%。定量 RT-PCR 检测表明，橡胶树 胶乳 2 个高丰度表达基因，即小橡胶粒子蛋白（SRPP）和橡胶延长因子（REF）基因，在均一化 cDNA 文库中的表 达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库，并对文库中随机的12 000 个克隆进行了测序，获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条，经拼接共获得单一基因 （unigene）为3 394个，其中包括片段重叠群（contig）2 061个和单一EST序列（singlet）1 333个。此cDNA 文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。 关键词：橡胶树；胶乳；均一化；全长cDNA文库 Construction and EST Analysis of the Normalized Full-Length Latex cDNA Library of Hevea brasiliensis ZENG Ri-zhong, DUAN Cui-fang, NIE Zhi-yi, DAI Long-jun, LI Yu (Institute of Rubber Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Ministry of Agriculture Key Laboratory for Rubber Tree Biology/State Key Laboratory Incubation Base, Danzhou 571737, Hainan ) Abstract: 【Objective 】Construction and normalization of the latex full-length cDNA library would facilitate the identification and analysis of the laticifer-specially expressed genes so as to gain insights into the molecular and regulatory mechanisms of the latex metabolism and the rubber biosynthesis that occur in the laticifers of rubber tree. 【Method 】Firstly, the primary full-length cDNA library was constructed with the latex of