王惠敏-药包材微生物检验演示幻灯片.ppt

药包材微生物检验;微生物的基本知识回顾;微生物的特点;葡萄球菌 ;菌落单位;包材的微生物污染;微生物检验;洁净室的启用 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。在检验开始前，应确保： a.洁净室房间、台面等已清洁消毒 b.洁净室已臭氧灭菌不少于半小时 c.洁净室净化空调系统持续运转不少于1小时，紫外灯已开启 d.洁净室中有压差要求的房间压差达到规定;实验器材、消耗品的准备 a.无菌衣、手套、口罩、试管、瓶子、培养皿、消毒剂配制缸、脱脂棉花球 b.一次性薄膜过滤滤器、微生物检查薄膜过滤仪 c.消毒剂、酒精灯;培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。培养基的制备是检验的重要一环。;培养基制备过程中的注意事项;培养基制备过程中的注意事项;75MM滤器;５０MM、75MM薄膜过滤器;黑曲霉在75MM膜玫瑰红钠形态;*;供试液的制备：略 过滤：取出三联过滤器，将其固定在集菌仪底座上。在火焰附近打开过滤器的针头，插入供试液瓶中。运行集菌仪调节泵速，一般在150左右 。（供试液过滤前先少量的灭菌水过滤以润湿滤膜） 细菌、霉菌、酵母菌的检验：过滤后取出滤膜（水要滤干，防止菌成片生长），菌面朝上贴于相应的培养基培养。每种培养基至少制备一张滤膜。 阴性对照试验：提取用水代替供试液同法操作。不得有菌生长。;;4 .控制菌检查 大肠埃希菌（常用，一般内用药包装材料）、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（一般外用药包装材料，如聚丙烯药用滴眼剂瓶） 直接将相应培养基加入过滤后的滤筒中培养。 阳性对照试验：同相应控制菌的检查，加入10-100cfu的对照菌，应检出相应控制菌。 阴性对照试验：提取用水代替供试液同法操作，不得有菌生长。;在操作中不应有大幅度或快速的动作； 使用玻璃器皿应轻取轻放； 在火焰上方操作； 带有菌液的吸管等应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒； 使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15min。;培养观察与结果判断;菌落计数 每片滤膜上的菌落数应不超过100个（否则要稀释后过滤）。 若滤膜上无菌数生长，以＜1报告菌数。 若两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上（例20，40需重新检验）。;控制菌的判断;大肠埃希菌的鉴定;大肠埃希菌的鉴定;在营养肉汤培养基中经35℃培养18-24h后，呈均匀浑浊生长。 分离培养：甘露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环。 卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈。 生化反应： 血浆凝固酶试验结果：＋ ;金黄色葡萄球菌的鉴定;金黄色葡萄球菌的鉴定;金黄色葡萄球菌的鉴定;分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基 生化反应： 氧化酶试验（＋） （培养物呈粉红色渐变为紫红色） 　　　　 绿脓菌素试验（＋） （盐酸溶液呈粉红色）;铜绿假单胞菌的鉴定;菌种的相关知识;1、我国的微生物菌种保藏机构;2、国外主要的微生物菌种保藏机构;我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供 美国ATCC、NRRL，荷兰的CBS ; 中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株; 美国国家菌种保藏中心提供的标准???株;菌种的采购 菌种的复苏 菌种的传代 菌种的使用 菌种的保藏 菌种的销毁;菌种的采购 向指定的菌种保藏机构购置。 所购菌种均为冷冻干燥菌种。 购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种 管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种 管标签等各项信息，确认无误后，置4～6℃暂存。 ;菌种的复苏;菌种的复苏;菌种的传代 应在生物安全柜中进行菌种的传代 。 美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。 我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。;常用的传代方法;菌种的传代; ; 平板划线法（streak plate method） ;菌种的使用;菌种的使用;菌种的保藏;菌种的保藏;菌种的保藏;菌种的传代、使用、保藏;菌种的销毁 过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃ 20分钟的生物灭活处理。