天然产物化学课堂教学方案-药学院.docVIP

药学院 《细胞工程实验》课堂教学方案 2014－2015学年度第一学期 授课年级 2013 专业层次 生化制药技术专科 授课班级 1、2 授课人数 50 授课教师 王慧 教师职称 讲师 药学基础教研室 2015年 3 月 16 日 药学院课教案 2015.5.9 星期-8节 地点 授课方式 方法手段 ；设问法；视频播放教学法。实验 目的 1 2、掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求。 3、掌握细胞培养用溶液的配制和消毒方法。 实验 重点 难点 重点 难点仪器 试剂 仪器高压灭菌锅 试剂Cl、KCl、Na2HPO4·H2O、KH2PO4、谷氨酰胺、青链霉素 教 学 基 本 内 容 实验原理 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，因此，细胞培养用品在细胞培养前，要进行消毒灭菌。对细胞培养用品进行消毒前，需进行严格包装，以便于消毒和贮存。实验步骤 ① 水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂 质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。 ② PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液 的配制)： 溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g， KH2PO4?0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 分装入500ml锥形瓶内待消毒：将PBS倒入锥形瓶内，放高压 蒸汽灭菌锅内消毒（121℃，20-30min ③ 胰蛋白酶溶液配制与消毒 称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成5ml小青霉素瓶，于-20℃保存以备使用。 ④ 青链霉素的配制和消毒 所用纯净水（双蒸水）需要高压蒸汽灭菌20分钟。具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克 ⑤ 谷氨酰胺的配制和灭菌 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水中，定容至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存 ⑥ RPMI1640的制备与消毒 溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入盛有双蒸水的烧杯中，并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中)，充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加一定的药品。然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,，使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 除菌：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。在超净工作台内过滤。 分装：将过滤好的培养液分装入100ml的盐水瓶中，置于4℃冰箱内待用。 使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效） 细胞培养用耗材的清洗、包装和消毒 ⑴ 玻璃器皿的清洗包装和消毒 ① 清洗：一般经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤 浸泡：玻璃器皿先用自来水简单刷洗，晾干或烘干后，用5%盐酸浸泡过夜，然后用自来水反复振荡冲洗后备刷洗，用过的玻璃器皿用后立即浸入清水中备刷洗。 刷洗：将浸泡后的玻璃器皿放入洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗，不要留死角。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干或烘干（50℃），备浸酸。 6小时，一般过夜或更长。 冲洗：浸酸后的器皿需用水充分冲洗，先用自来水反复冲洗3次以上，然后用蒸馏水冲洗2-3次，晾干或烘干备用。 ② 包装：材料常用牛皮纸、报纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等。小的培养皿用牛皮纸包装后在放入饭盒内，较大的器皿可进行局部包扎。 ③ 消毒：玻璃器皿的消毒可用高温湿热灭菌（高压灭菌锅--121℃，20-30min160℃，90-120min ⑵ 金属器械的清洗包装和消毒 ① 清洗：使用后放入含洗涤剂的水中，反复刷洗，自来水反复冲洗干净，晾干，用75%酒精擦拭，自来水反复冲洗，最后用三蒸水浸洗3次，晾干或50℃烘干备用 ② 包装：用牛皮纸包装后放入铝饭盒内； ③ 消毒：高温湿热灭菌（高压灭菌锅--121℃，20-30min160℃，90-120m