[]微生物蛋白的提取和分离纯化.ppt

微生物中蛋白的分离纯化 用途: 药物——多肽 饲料——菌蛋白 工业——酶 蛋白质的分离纯化步骤 (1)生物组织的机械破碎。 (2)抽提：根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 用离心法除去固体杂质后，可通过沉淀法、膜分离法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。 根据所需的目的蛋白制定蛋白提取和纯化的策略和步骤 一般的预处理：过滤（工业生产）和离心（实验室研究） 细胞破碎和蛋白质溶解 机械法 匀浆、研磨、压榨、超声等 非机械法 渗透、酶溶、冻融、化学等 新方法 激光破碎、冷冻喷射、相向流撞击等 胞外酶 取预处理后的上清液（滤液），根据目的蛋白的相关性质，采用相关的方法提取纯化目的蛋白。 举例： 壳聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件的优化及壳聚糖酶的分离纯化 层析过程 （1）装柱 （2）平衡（equilibrium) （3）上样(loading) （4）洗涤(washing) （5）洗脱(elution) （6）清洗与再生 离子交换柱特点 料液处理量大，在适宜的操作条件下，分离过程具有浓缩作用； 分辨率较高：优化操作条件可大幅度提高分离的选择性；所需柱长较短可在较高流速下操作； 吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高； 离子交换剂种类多，选样余地大，价格也远低于亲和吸附剂。 层析条件——离子强度、pH值 、流速等。主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。 一般来说，pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小；同时pH也影响样品组分的带电性。 离子强度增大，交换容量则下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要通过降低交换容量把结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。 离子交换柱层析的操作要点 1.平衡缓冲液 2.上样 3.洗脱缓冲液 4.洗脱速度 洗脱 按操作方式 A.恒定洗脱 (isocratic elution) B.分步洗脱 (stage elution) C.梯度洗脱 (gradient elution 凝胶柱特点 特点： （1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性； （2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需进行浓缩 Sephaery1S一200HR层析 Sephacryl High Resolution（即Sephacryl HR）系列凝胶：是由烯丙基葡聚糖通过N, N′-亚甲基双丙烯酰胺交联而成。 凝胶的网孔特性由葡聚糖组分来控制，形成分级范围不同的五种类型：S100~500 HR，其中，数字越大，孔径越大。 特点： 介质的颗粒尺寸分布较窄，柱效高（9000塔板数/米）； 在机械强度、理化特性、化学稳定性及热稳定性等方面均优于传统凝胶介质 由于其机械强度高，适合在高流速下进行快速分离； 可以用0.5 mol/L NaOH作为清洗剂 在pH 7时能承受121℃、30 min反复高温灭菌而不会对层析效果产生明显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用 Supedrex-75层析柱 Superdex系列凝胶：是将葡聚糖与高交联度的琼脂糖颗粒共价结合而形成的。其中，琼脂糖基质决定了凝胶具有高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝胶的层析特性。 根据分级范围不同，可分为若干型号。其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。 Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ） Superdex系列凝胶是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一 颗粒尺寸很小，大小分布均匀，填充成层析柱后柱效非常高（最高可达30000塔板数/米），即使在很高的流速下仍能获得非常高的分辨率 ； 在机械性能、化学稳定性及热稳定性等方面均大大优于传统凝胶介质。 凝胶过滤层析的操作过程 1. 凝胶的选择 2. 装柱 3. 平衡（equilibrium) 4. 上样(loading) 5. 洗脱(elution) 6. 凝胶再生和保养 在蛋白质纯化的起始阶段，合适的粗分离手段能大大降低后续操作的难度。在传统的粗分离方法中，实验室一般