FCM的原理及应用.pptxVIP

流式细胞术 ---原理及应用;什么是流式细胞术？ 流式细胞仪由哪些结构组成？ 各个系统的工作原理是什么？ 流式细胞仪能做些什么？ ;1.1 流式细胞术简介;检测对象：单细胞悬液或生物颗粒 检测特点：单细胞水平分析 可对目标细胞进行分选 ;流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准； WB ：群体分析，得到多个细胞的平均值。 ;1.2 流式细胞仪的结构组成;;;进样速率控制;光收集系统;;流式细胞仪信号检测系统;FACS Canto II 双激光六色;电子系统;（一）光电检测器(photodetector);（二）电信号两种放大方式;1.3 流式细胞术光信号检测;散射光信号;（二）侧向散射光SSC;（三）散射光的作用;阈值 Threshold; 荧光信号;（二）常用荧光素;核酸荧光染料 PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。 Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。 PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。;细胞周期 (Cell Cycle)原理：细胞在有丝分裂的过程中，核内的 DNA 会进行复制，造成 DNA 含量的变化。如果把处于G0/G1 期的细胞的 DNA 含量看做 2N 的话，处于 G2/M 期的细胞的 DNA 含量则为 4N。荧光染料碘化丙锭（Propidium Iodide， PI）是一种核酸特异性染料，染料的荧光强度与结合的 DNA 数量成正比。根据 PI 的这种特性，我们常常用它来揭示细胞内 DNA 倍性的关系，从而推导出细胞群体的周期分布。 细胞凋亡 (Apoptosis)原理：细胞程序性死亡/细胞凋亡（apoptosis）是机体移除不需要的细胞的一种常见的机制。细胞凋亡早期的标志事件之一是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）从胞膜内表面到外表面的转移。Annexin V （AV）和 PS 有很强的亲和力，所以被荧光标记后常常在流式中被用来检测外翻的 PS。 在细胞凋亡后期，细胞膜与核膜常常会破裂。这种现象在流式中可以用 Propidium Iodide （PI）检测。PI 是一种核酸特异性染料。当细胞膜完整时，PI 无法穿透胞膜，故无法对细胞核进行染色。 AV 与PI 共同使用时，可以对细胞凋亡的各个时期进行检测：正常活细胞显示 AV 和 PI 的双阴性；早凋细胞显示 AV 阳性和 PI 阴性；晚凋细胞则显示 AV 和 PI 的双阳性。然而，可以被 AV 和 PI 共同染色的细胞并不一定处于凋亡晚期。坏死的细胞在晚期也会被 AV 和 PI共同染色。所以要想做到对细胞凋亡精确的检测则需要对整个凋亡过程进行监测，即 AV 阴性 PI阴性 → AV 阳性 PI 阴性 →AV 阳性 PI 阳性。  ;FCM可检测下列细胞成分： 表面标记物 胞浆标记物 核内标记物 可溶性成分;免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。;荧光抗体的选择;B 根据抗原表达强弱合理选择抗体 不同的荧光素强度有所不同； 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE ;光谱重叠与补偿