实时荧光定量PCR-[兼容模式].pdfVIP

实时荧光定量实时荧光定量PCR （（real-time quantitative 实时荧光定量实时荧光定量 （（ PCR，，qPCR ）的原理和应用）的原理和应用 ，， ））的原理和应用的原理和应用 PCR(Polymerase Chain Reaction ): 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种扩增特定的DNA片段的分子生物学技术, 能将微量的能将微量的DNA大量复制DNA大量复制 。 能将微量的能将微量的DNADNA大量复制大量复制 94℃ PCR分四个阶段 普通普通PCR技术技术： qPCR技术技术： 普通普通 技术技术 技术技术 扩增目标DNA量，对目标DNA qPCR技术是 PCR实验方法 片段做定性分析，但无法准确 的基础上发展而来的技术，能 得知目标DNA的含量 够对PCR扩增的目标DNA进行 定量分析。具有灵敏度高、特 异性强、有效解决PCR污染问 题、自动化程度高等特点 优点优点：实时监测、不需电泳、精确定量等 优点优点 一、一、qPCR定义定义、原理和常用荧光染料、原理和常用荧光染料 一一、、 定义定义、、原理和常用荧光染料原理和常用荧光染料 qPCR PCR的基础上加入荧光 染料或荧光探针，利用荧光信号 累积实时监测整个PCR反应过程， 最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析。 SYBR greenSYBR green是目前最常用的荧是目前最常用的荧是目前最常用的荧是目前最常用的荧 是目前最常用的荧是目前最常用的荧是目前最常用的荧是目前最常用的荧 光染料光染料，，它能够结合双链状态的 光染料光染料，， DNA分子，一旦结合就能够发出 荧光，但未结合DNA的游离 SYBR green没有任何荧光。 SYBR green荧光强度反映了当前样品中的DNA浓度 实时荧光扩增曲线图实时荧光扩增曲线图 实时荧光扩增曲线图实时荧光扩增曲线图 在反应结束后检测荧光值：此时荧光值与初始DNA浓度不成线性关系 （平台期） 在指数增长期检测荧光值：无法在同一时间点保证所有样品都处在对数增长期 阈值阈值 在指数增长期选择一个荧光阈值，浓度高的样品比浓度低的样品 先到达阈值 为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技 术中引入了几个重要的概念 • 基线基线 （（Baseline））：是指在PCR扩增反应的最初 基线基线 （（ ）） 数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直 ， 这样的直线即是基 。 • 荧光阈值荧光阈值 （（threshold ））C ：：是在荧光扩增曲 荧光阈值荧光阈值 （（ ）） T ：： 上人为设定的一个值上人为设定的一个值，，它可以设定在荧光信号指它可以设定在荧光信号指 数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基 （背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。荧 光域值是PCR的3—15个循环荧光信号标准差的 10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期 。 阈值阈值