试验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法.PDFVIP

实验二 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf 值（比移）来表示的： 原点到层析点中心的距离 R f 原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤 纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、器材 1、层析缸 2 、毛细管 3 、喷雾器 4 、培养皿 5 、层析滤纸（新华一号） 四、试剂 1、扩展剂：饱和正丁醇：醋酸=4 ：1 40ml 正丁醇+10ml 冰醋酸+30ml 蒸馏水→分液漏斗充分混合→弃下层水→平均分 成3 份→取5ml 于小烧杯中，其余（约20ml ）置培养皿中→置密闭层析缸中。 2 、氨基酸溶液：0.5% 的赖氨酸Lys 、脯氨酸Pro 、缬氨酸Val 、苯丙氨酸Phe 、亮氨酸Leu 溶液 及它们的混合液（各组份浓度均为0.5% ）。各5mL 3、显色剂：50~100mL 0.1%水合茚三铜正丁醇容液。 五、操作 1、将盛有平衡溶剂（5ml 扩展剂）的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2 、取层析滤纸（长22cm、宽 14cm）一张。在纸的一端距边缘2cm 处用铅笔划一条直线，在 此直线上间隔2cm 作一记号。 3、点样：用毛细管将各氨基酸样品（5 种标样，1 种混样）分别点在这6 个位置上，干后再点 一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过5mm 。 4 、扩展：将点好样品的层析滤纸卷成圆筒状，使基线吻合，两边不搭接（中间留一个 1-2cm 的缝隙），用棉线将滤纸缝合成筒形，置于放有展层剂的培养皿中，加盖层析缸，密闭。 溶剂上升12-15cm 时取出，剪开，沿溶剂前沿划一直线，置于烘干箱70-90℃烘干。 5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5 分钟（100℃）或用 热风吹干即可显出各层析斑点。 6、用铅笔画出斑点范围和中心点，计算各种氨基酸的Rf 值。 六、安排与要求 分组：层析缸使用与溶剂配制3 人一套，层析每人做1 份。 请学生自带直尺、铅笔以及镊子、胶带纸。 作业： 1、列表计算各种氨基酸的Rf 值。2 、何谓Rf 值？影响Rf 值的主要因素是什么？ AA R r Rf 标样 Lys 混样 Pro Val Phe Leu [层析技术介绍]： 1903 年，俄国植物学家 Tsweet 发现植物叶子中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成 色谱，故称这种混合物分离的方法为色谱法，又称色层分析法或层析法，随后被广泛用于无色物质 的分离与层析。1931 年有人用氯化铝分离了胡萝卜素的两种同分异构体。1944 年用滤纸作为固定支 持物的“纸层析”诞生。英国生物学家Martin 和Synge 总结为塔板理论，标志层析理论和技术的诞 生。 近半个多世纪以来，层析技术发展很快，气相层析、高效液相层析、凝胶层析等方法和技术相 继出现。由于这一技术具有分离效率高、应用范围广、分析速度快、样品用量少、易于自动化及能 够与其他方法配合使用等优点，因此近年来在各类分析化学方法中占有十分重要的地位，已成为生 物化学、分子生物学、生物工程等学科的重要研究手段。 层析法各种各样，但基本原理是一致的。它是利用混合物中各组分理化性质（分子形状和大小、 带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性以及分子的亲和力等）的差别，使各组分以不 同程度分布在两相中，其中一相为固定的（称为固定相），另一相则流过此固定相（称为流动相）， 造成流动相对固定相作单向相对运动，流动相推动样品中各组分经固定相向前迁移，使各组分迁移 速度不同，而对物质进行分离的方法。固定相可以是固体、液体或一种固体和一种液体的