[理学]文库构建及酵母双杂交技术.pptVIP

2.2反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)； 应选用甲基化dCTP； 应保证所获得双链cDNA的方向性。 * * * * * 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体 ：?载体系列（ 容量为 24 kp ）、cosmid载体（容量为 50 kb ）、YAC（ 容量为 1 Mb ）、BAC（ 容量为 300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 ?噬菌体载体构建基因组文库 2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 ?? 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 PolyAT tract mRNA的分离纯化过程 cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 寡聚(dT)12-18 随机6碱基引物R6 寡聚(dT)12-18 随机6碱基引物R6 mRNA (A)n (T)12-18 (A)n (A)n (T)12-18 R6 R6 R6 R6 R6 R6 第二链合成 (A)n (T)12-18 (A)n R6 R6 R6 R6 R6 R6 (A)n (T)12-18 EcoRI EcoRI 加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级 cDNA合成完毕，准备连接 第一链合成 cDNA合成过程示意图 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术 cDNA合成的分子修饰 接头及引物序列 无RNaseH活性的反转录酶，5’甲基化的dNTP RNaseH，DNA聚合酶I EcoRI接头，T4连接酶 XhoI酶切 完整有方向的cDNA XhoI XhoI EcoRI XhoI XhoI cDNA文库的构建 cDNA 3′ （3′RACE 法） 端的快速扩增法 (RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends) 3 RACE技术 3`-Full RACE法 cDNA 5′ （5′RACE 法） 端的快速扩增法 (RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends) ●Self-Ligation 法 5 ’ RACE原理 使用 RNA Ligase 的 5’ RACE 法 ● Self-Ligation Method ● Adaptor-Adding Method 2. 使用TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) 的 5’ RACE 法 5’ RACE 法种类 Adaptor-Adding Method 原理 TdT 法原理 几种 5’ RACE 法的比较 90年代，纽约大学的S. Field等建立。有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的