[理学]生物分离工程第四章 沉淀分离法.ppt

大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。 浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含0.1%。 粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。 对于这些浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。 而有些发酵液，使用助滤剂有利于过滤分离，而还有一些发酵液则不行。 问 题 固液分离：第一选择为过滤， 过滤技术难处理的发酵液如何处理？ 第二选择离心分离。 离心法与过滤法的比较 离心分离原理 离心力： Stock’s Force(粘滞吃力)： 离心沉降速度： 分离因子定义Fr：离心力/重力加速度(g)的比值 意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心机的分类 离心技术分类 按分离因子Fr分类 1)、常速离心机Fr 3,000g 三足沉降式: 500-1000g 螺旋卸料式：1200-3000g 2)、中速离心机，Fr = 3,000 — 5,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 3)、高速离心机，Fr = 5,000 — 20,000g 多室离心机：2000-8000g 碟片式离心机：3000-10000g 管式离心机：8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 — 1,000,000g 二、沉淀分离法 （一）概述 定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程 与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。 区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。 2、类型 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 高分子聚合物沉淀法 金属离子沉淀法 沉淀法操作步骤 在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 沉淀物的陈化，促进晶体生长； 离心或过滤，收集沉淀物； （二）盐析沉淀法 定义——在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程 2.盐析原理 首先需要了解蛋白质的特性： 是高分子两性电解质，主要由 疏水性不同的氨基酸组成，蛋 白质表面由不均匀分布的荷电 基团形成荷电区、亲水区和疏 水区构成。大部分蛋白质溶于 水，是以亲水胶体的形式或大 分子溶液存在的。 蛋白质溶液的稳定性 电荷稳定性： 两性电解质，由于静电斥力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 空间稳定性： 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，形成稳定的胶体溶液。 可以通过降低蛋白质周围的水电层和双电层厚度降低蛋白质的稳定性而使蛋白质沉淀。 盐析示意图 3.盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀； 离子强度对盐析过程的影响 盐析沉淀平衡式（Cohn经验公式） S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 β和Ks的物理意义 β—截距常数,与盐的种类无关，但与蛋白质的种类、温度和pH值有关。(β= log S0) Ks—盐析常数，与温度、pH值无关，与蛋白质和无机盐的种类有关。 4、盐析剂的选择 盐析剂的条件 盐析作用要强： 盐析能力— 阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子 有较大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能小。 盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不要引入不易分离的杂质。 来源丰富、经济 常用盐析剂—(NH4)2SO4 、Na 2SO4、磷酸盐、柠檬酸盐等。 最常用 (NH4)2SO4 优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。 次常用Na 2SO4 。缺点：在40度以下溶解度较低，因此主要用于热稳定蛋白。 5、影响盐析的因素 溶质分子种类的影响：Ks和β值 溶质浓度的影响：蛋白质浓度大