[理学]第三节 目的基因的获得.pptVIP

第三节 目的基因的获得 PCR的反应过程 变性：使DNA双链解离变为单链。一般94℃～95℃，1min足以使模板变性 若低于94℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 PCR的反应过程 退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。 退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 ℃之间。 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复性温度的计算公式 Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值－（5～10℃）； 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性； 复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。 PCR的反应过程 延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则不断合成DNA片段。延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 PCR的反应过程演示 设计引物 引物设计的原则： （1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 设计引物 （6）引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）， 5’端无严格限制。 （7）引物5′端可修饰 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。 提取基因组DNA 模板DNA的来源： 微生物中提取DNA 植物中提取DNA 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系 PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加 进行PCR反应 进行电泳检测 电泳检测：对PCR的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。（例如下面是VvSUC11基因的电泳结果） 二 RT-PCR法 RT-PCR的定义：是将RNA的反转录（ reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法。 RT-PCR的过程 试管内逆转录反应 RT-PCR结果的电泳检测 例如下面是基因VvSUC11和VvSUC12的RT-PCR结果： 三 CDNA文库法 基因文库(gene library):将生物材料的基因组 DNA或cDNA片段化，然后与特定的载体连接导入宿主菌形成的包含有目的基因在内的DNA片段的克隆群体（集合）。 按照外源DNA片段的来源，基因文库可分为：基因组文库和cDNA文库。 基因组文库(genomic library):是指将某生物体的全部基因组DNA用限制酶或机械力切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 cDNA文库 (cDNA library): 是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。 cDNA文库仅包含所选材料在特定时期表达的基因，且这些基因在表达丰度上存在差异 cDNA文库的构建 1、cDNA文库的构建 （1）分离提取细胞总RNA （2）mRNA与其他RNA的分离。mRNA仅占总RNA的1~2%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开。 mRNA与其他RNA的分离 (3) 以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链 mRNA纯化后，加入oligo(dT)作为引物，以提供3’-OH引导DNA链的合成， 同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-DNA杂合分子。 以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链 （4）cDNA第二链的合成 自身引导法 获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 （4） cDNA第二链的合成 置换合成法 获得的双链cDNA 5’端也会有几