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微生物工程综合性实验 产蛋白酶海洋细菌的分离、培养条件优化和高产菌选育 作者：XX XXYY XXYYz 实验目的：通过本次实验，我们可以初步掌握细菌的分离、培养条件优化及高产菌选 育等操作，在参照课本、查找资料、分析思考中加深对微生物工程课知识 的掌握和理解，增强实验操作技能。同时也可以体验到亲自分离高产菌株 的乐趣。 一、实验材料与试剂： 材料：海泥—取自胶州湾。 试剂： 蛋白胨、干酪素、酵母粉、牛肉膏，海水、葡萄糖、乳糖、甘油、柠檬酸钠、海藻 糖和可溶性淀粉等。 二、培养基： 1．筛选培养基：酪蛋白培养基（g/L）：干酪素10，海水配制，pH =10.0. 2、富集培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，海水配制，pH=8.5 3、生长培养基 (g/L)：蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，海水配制， pH=8.5 4、2216E培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，海水配制，pH=8.5 5、产酶发酵培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉3，葡萄糖5，海水配制，pH=8.5 三、设计思路： （一）菌种分离实验： 1、培养基： 筛选培养基：酪蛋白平板 富集培养基； 2216E培养基， 生长培养基（基本培养基）。 2、设计思路：【1】 ① 富集：取1g 海泥放入50ml富集培养基，混匀；取海鱼或贝类内脏，剪碎后放入无菌 海水浸泡过夜，过滤后取1ml上清液放入富集培养基，20℃、180r/min培养2～ 5d。 0 -1 -2 -3 ② 筛选：取富集培养液，用无菌海水稀释10、10 、10 、10 四个梯度，涂布在酪蛋白 平板，每个梯度设置三个平行实验，20℃，培养3～4d，挑选有透明圈的单菌 落. ③ 纯化：挑取单菌落，分别划线分离纯化。【2】 ④ 保藏：划线分离纯化后，分别接种于2216E 培养基保藏。分别定期进行传代培养。 ⑤ 传代：取保藏菌种接【3】种到生长培养基中，每组接种五管。20℃、180r/min，每 隔24h（或稍长）转接到一新瓶培养基中。 （二）培养条件优化实验： 1、培养基： 基本培养基 发酵培养基 2、设计思路： ① 种子液的制备：将保藏在2216E 培养基的斜面菌株接种到发酵培养基中，转速 180r/min，装液量20﹪培养16小时。 ② 探究不同碳源对目的菌的影响： 在一组生长培养基中分别加入终质量浓度为0.5g/dL的葡萄糖、乳糖、甘油、 柠檬酸钠、海藻糖和可溶性淀粉。种子液按体积分数2﹪接种于各实验培养基中。 对照组为生长培养基。20℃、180r/min，振荡培养，每隔12h测定细胞浓度， 直至细胞浓度下降为止。记录实验数据。 ③不同初始pH对细菌生长的影响： 在发酵培养基中加入不同缓冲液，调节各自的pH值分别为4.0,5.0,6.0,7.0, 8.0,9.0，种子液按体积分数2﹪接种于发酵培养基，于20℃、180r/min培养， 每隔2h测定细胞浓度。 （三）高产菌选育： 采用紫外诱变提高碱性蛋白酶的活性。【4】 1．制备菌悬液： ① 取生长24h的菌株斜面（生长培养基）3支，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下， 倒入一支大试管中，将试管在振荡混合器上震荡30s.，以打散菌块。 ② 将上述菌液离心（3000r/min？，10min），弃去上清液。用无菌生理盐水将菌体洗 涤2~3此，制成菌悬液。 ③ 用显微镜直接计数法【5】计数，调整细胞浓度为10^8个/mL。 2.平板制作：