05-蛋白质的分离、纯化和表征.pptVIP

蛋白质的分 离、纯化和表征 第五章 一、蛋白质的基本性质 1、 蛋白质是两性电解质 蛋白质是两性电解质，可解离基团 主要是侧链R基上的官能团以及肽链N末 端的-NH2和C末端的-COOH 天然状态下，蛋白质的大部分可解 离基团可被滴定 * 一、蛋白质的基本性质 * 一、蛋白质的基本性质 等电点(pI)： 蛋白质所带电荷的性质和数量取决于分子中可解离基团的种类、数目及溶液pH值。净电荷为0时的pH是该蛋白质的等电点 * 等离子点： 当没有中性盐的阴、阳离子干扰时，蛋白质分子中解离的质子数与接受的质子数相等时的pH是蛋白质的等离子点 一、蛋白质的基本性质 2、沉降系数和沉降系数单位 在强大的离心力场作用下，蛋白 质密度大于溶液密度时就会沉降，沉 降速率与蛋白质分子的大小和密度及 分子形状、溶液密度和粘度等有关 * 一、蛋白质的基本性质 沉降系数： 单位离心场的沉降速度，以s表示 沉降系数单位(Svedberg单位)： 将10-13秒作为一个单位，用S表示 人Hb的沉降系数为4.46S 沉降系数常用来近似描述生物分子的大小 * 一、蛋白质的基本性质 * 蛋白质 相对分子量 扩散系数 沉降系数 摩擦比 (D20,W× 107)cm2s－1 (s20.W× 10-13) (f/f0) 核糖核酸酶（牛） 12600 11.9 1.85 1.14 细胞色素c（牛心肌） 13370 11.4 1.71 1.19 肌红蛋白（马心肌） 16900 11.3 2.04 1.11 胰凝乳蛋白酶原（牛胰） 23240 9.5 2.54 1.19 β－乳球蛋白（山羊乳） 37100 7.48 2.85 1.26 血红蛋白（人） 64500 6.9 4.46 1.16 血清清蛋白（人） 68500 6.1 4.61 1.29 过氧化氢酶（马肝） 247500 4.1 11.3 1.25 血纤蛋白原（人） 339700 1.98 7.63 2.34 肌球蛋白（鳕鱼肌） 534800 1.10 6.43 3.63 烟草花叶病毒0.46 198 2.03 一些蛋白质的常数 一、蛋白质的基本性质 3、 蛋白质的胶体性质与沉淀性质 分散相质点 1 nm，真溶液 100 nm，悬浊液 1-100nm之间，胶体溶液 蛋白质分子大小介于胶体质点范围 蛋白质溶液由水化层和双电层稳定 * 一、蛋白质的基本性质 蛋白质的沉淀方法 1）盐析法(不会使蛋白质变性,可逆) 2）有机溶剂沉淀法(易使蛋白变性) 3）重金属盐沉淀法(易使蛋白变性) 4）生物碱试剂和酸沉淀 单宁酸、苦味酸、KI、磺基水杨酸、HNO3 5）加热法 * 二、蛋白质的分离纯化 (一)、一般原则 1、前处理 动物组织或细胞：匀浆器、超声波 植物组织和细胞：研磨、纤维素酶 细菌细胞：高压挤压、溶菌酶 2、 粗分离：等电点沉淀、盐溶、盐析 3、 细分级分离：层析法和电泳法 4、 结晶 * (二)、方法 1）溶 解 度（等电点沉淀、盐溶盐析、有机 溶剂分离和温度的影响） 2）分子大小（透析和超过滤、密度梯度离心、 凝胶过滤） 3）电荷性质（电泳和离子交换层析） 4）吸附性质（层析） 5）对配体分子的生物学亲和力 * 依据如下性质选择和建立提纯方法： 2、盐溶和盐析 盐溶（salting in） 加入低浓度中性盐使蛋白质溶解度提高的现象 盐析：加入饱和或半饱和中性盐时，蛋白质溶解度降低并析出的现象 * pH和离子强度对β－乳球蛋白溶解度的影响（曲线上的数值为NaCl 浓度） 1、等电点沉淀和pH控制 不同的蛋白质有不同的等电点,调节溶液的pH, 可分离蛋白质混合物 (二)、方法 3、电泳(electrophoresis) 电泳 在外电场作用下带电颗粒向着与其电 性相反的电极移动的现象 电泳迁移率或泳动度（μ） 单位电场强度下蛋白质分子在溶液中 的移动速度