2 蛋白质的表征.pdfVIP

第二部分第二部分 蛋白质的表征蛋白质的表征 宣劲松 北京科技大学北京科技大学 1 1 Click to add Title 蛋白质的定量 2 Click to add Title 蛋白质纯度的测定 3 Click to add Title 蛋白质分子量的测定 4 Click to add Title 蛋白质等电点的测定 5 蛋白质翻译后修饰的分析 Click to add Title 11. 蛋白质的定量蛋白质的定量 蛋白质定量分析通常是指测定蛋白质溶液中的蛋白质 的量或蛋白质粉剂中蛋白质的量。在进行蛋白质含量测 定时定时，首先根据蛋白质的物理化学性质的特性和实验室首先根据蛋白质的物理化学性质的特性和实验室 的现有条件来确定测定方法。 蛋白质含量测定方法有很多蛋白质含量测定方法有很多，如如：：定氮法定氮法，比色法等比色法等。 采用的测定方法不同得到的测定结果有差异。每-种方法 有有它独特的优点独特的优点，，但是是也有有它的局的局限性性。 测定蛋白质含量通常要采用两种以上的方法，要根据 蛋白质的某些特性选择不同的方法进行测定。将多种方 法测得的结果综合考虑。 3 1.1 紫外吸收法 1.2 Folin-酚法 (Lowry法) 1.3 3 BCA (Bicinchoninic Acid) Assay 11.44 44 考马斯亮蓝考马斯亮蓝GG-250250 比色法比色法(B(Bradfdfordd法法)) 11.55 利用微波快速蛋白质定量法利用微波快速蛋白质定量法 11.11 紫外吸收法紫外吸收法 a. 近紫外吸收近紫外吸收(280 nm) 溶液中蛋白质的含量可以利用分光光度计进行测定溶液中蛋白质的含量可以利用分光光度计进行测定。。 蛋白质在近紫外区的吸收主要依赖蛋白质中Tyr和Trp的含 量量((很少的因素来自很少的因素来自PhePhe和二硫键和二硫键)) 。。因此在不同的蛋白质中因此在不同的蛋白质中，， A280值会有很大的差异。 5  优点： 方法简单；样品可以回收利用。  缺点： 会受到其它一些生色基团的影响；对于指定蛋白的特定 吸收值需要具体测定吸收值需要具体测定；；会受到核酸的影响会受到核酸的影响((核酸在核酸在280nm 同同 样有吸收并且很强，可以是蛋白质光吸收的10倍左右。) 6 bb. 远紫外吸收远紫外吸收  肽键在约190nm的远紫外区具有很强的光吸收；  由于氧气在该波长段的干扰以及传统分光光度计在该波长 的灵敏度低的灵敏度低，，所以测量通常选择所以测量通常选择205nm ，，蛋白质在蛋白质在205nm 处的吸收将是在190nm处的一半；  含有不同侧链的氨基酸含有不同侧链的氨基酸，，包括包括TTrp, PhPhe, TTyr, HiHis, CCys, MMett, Arg 的侧链(递减的顺序)对于A205均有贡献。 7  优点优点： 方法简单而且灵敏；样品可以回收利用；不同蛋白 质之间的变化较小。  缺点： 需要对分光光度计远紫外区的精确度进行校准需要对分光光度计远紫外区的精确度进行校准；； 很多缓冲液和化合物如亚铁血红素或吡哆醛基团在 该波长段均有强烈的光吸收。