菌落计数常用稀释涂布平板法.pptVIP

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 专题2 微生物的培养与应用  1.分离微生物的原理 2.利用选择培养基分离细菌 3.统计细菌数目的方法 尿素的发现历史 1773年，伊莱尔·罗埃尔（Hilaire Rouelle）发现尿素。1828年，德国化学家弗里德里希·维勒首次使用无机物质氰酸铵（NH4CNO，一种无机化合物，可由氯化铵和氰酸银反应制得)与硫酸铵人工合成了尿素。本来他打算合成氰酸铵，却得到了尿素。尿素的合成揭开了人工合成有机物的序幕，实际上开辟了有机化学。 一、课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2) 脲酶 + CO2 NH3 + H2O 3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 1.怎样才能从土壤中分离出分解尿素的细菌呢？ 二、研究思路 （一）筛选菌株 水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克（T.Brock) 1966年发现耐热细菌 a.提出的问题 —如何寻找耐高温的酶？ b.解决问题的思路 —寻找耐高温环境； c.原理 —高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 启示： :要分离某种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等方法： ⑴抑制大多数微生物不能生长， ⑵造成有利于该菌生长的环境。 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 （二）实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 概念：选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基:分离自生固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞 KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。 （1）该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ （2）此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生存。 （三）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需 培养基 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁殖，而受到抑制，所以用此培养基能够选择出分解尿素的微生物。 （四）统计菌落数目 1、显微镜直接计数： （1）方法：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； （2）缺点 （四）统计菌落数目 1、显微镜直接计数： 2、活菌计数法（间接计数法) （1）操作方法： 稀释涂布平板→统计菌落数 （2）原理： 1个菌落→1个活菌 （3）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M 其中C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积； M:稀释倍数。 当样品的稀释度足够高时，固体培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算