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western试剂准备
一、试剂配制：
1. 2×SDS凝胶加样缓冲液：
100 mmol/L Tris·HCl(6.8)
200 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）
4% SDS（电泳级）
0.2% 溴酚蓝
20% 甘油
不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。
30%丙烯酰胺溶液
将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为0ml的水中。，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于℃。1mol/L二硫苏糖醇（DTT）在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
5. 1 mol/L Tris·HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 30.28 g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
6. 电泳缓冲液
Tris（MW121.14） 3.03 g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000 ml
7. 转移缓冲液：
甘氨酸（MW75.07） 2.9 g
Tris（MW121.14） 5.8 g
SDS 0.1 g
甲醇 200ml （最后加入）
蒸馏水至 1000 ml
细胞裂解液：临用前加入蛋白酶抑制剂PMSF。
Triton-100 1% TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L NaCl 150mmol/L
9 蛋白酶抑制剂：PMSF 100mM/L（剧毒物品）
称量0.174g PMSF(针状结晶固体)溶于10ml 异丙醇,震荡混匀，保存４. 裂解操作加入4预冷裂解液00 μl,加PMSF到终浓度为1mM/L。
剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀4℃放置15~30 min4℃离心，1, 10 min， 取上清备用。。
SDS分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
成分 配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/mL 5 10 15 20 25 30 40 50 6%胶 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺混合液mL 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0 1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵μL 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMEDμL 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04 8%胶 5 10 15 20 25 30 40 50 水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 30%丙烯酰胺混合液μL 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.3 1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵μL 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMEDμL 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03 10%胶 5 10 15 20 25 30 40 50 水 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%丙烯酰胺混合液μL 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7 1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵μL 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4
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