3 应用生物技术(第三部分).ppt

应 用 生 物 技 术Applied Biotechnology 长江大学生命科学学院 第三部分 动物生物技术 第五章 动物及家畜的分子标记与基因克隆 第六章 转基因动物及应用 第五章 动物及家畜的分子标记与基因克隆 第一节 动物分子标记与基因定位 一、 构建分子标记动物遗传连锁图 DNA标记种类常用的有： RFLP：限制性片段的长度多态性 RAPD：随机扩增DNA多态性 AFLP：扩增片段长度多态性 VNTR：数目可变的串联重复序列 PCR-SSCP：单链构象多态性 SSR：简单重复序列 PCR-DGGE：变性梯变电泳多态DNA 等等。 微卫星DNA标记：由可变数目串状重复序列造成，2-4 bp。不直接作探针，而是根据两端引物扩增。 小卫星DNA标记：由可变数目串状重复序列造成，10-25 bp。可作探针。 ① 猪（牛、羊）基因组遗传连锁图 Visscher等（1995）：构建了猪基因组遗传连锁图，1000个高度多态性微卫星标记间隔分布，精度是20 cM。 ② 家蚕连锁图谱构建 1990年，美国Goldsmith提出“国际蚕计划”设想，计划用300个RFLP标记，获得间隔10 cM连锁图。 Goldsmith MR等（1994）：构建了家蚕RFLP图谱，但密度较低。 1995年日本东京大学Promboon A等构建了家蚕RAPD图谱，但密度较低，获得168个RAPD标记。 1998年日本蚕丝试验场的Yasukochi绘制遗传连锁图谱400个遗传标记（包括部分形态标记、同工酶标记、RFLP标记和RAPD标记）平均距离10 cM。（共用1018个分子标记，有些无多态性） 见《昆虫学报》2001，44（4）上的二篇文章。 何宁佳等，结合SADF与RAPD标记构建家蚕连锁图，昆虫学报，2001，44（4）：476~482 朱玉芳等，家蚕AFLP连锁框架图谱的构建，昆虫学报，2001，44（4）：483~493 本文朱玉芳等（2001）AFLP连锁图：28 groups，2998.9 cM，平均图距4.5~36.7 cM。 ③ 鲤鱼的遗传连锁图谱 1997年，美国农业部正式确立5种水产养殖动物的基因组计划，其中： John等（1998）：斑马鱼遗传连锁图谱； Thomas DK等（1998）：鳟鱼遗传锁图谱； William PY等（1998）：罗非鱼遗传连锁图谱。 孙效文等，鲤鱼的遗传连锁图谱（初报），中国水产科学，2000，7（1）：1~5 该图谱共用了262个标记： ▲ RAPD标记56个 ▲ 鲤鱼SSLP标记26个 ▲ 鲫鱼SSLP标记19个 ▲ 斑马鱼SSLP标记70个 ▲ 鲤鱼基因标记91个 50 groups，5789 cM。 二、图谱定位动物重要性状基因（包括QTL） ① 四川农业大学胡刚安博士论文（1997）： 以岭南黄鸡A系和清远麻鸡为亲本组建F2分离群体，对鸡19种产肉性状基因位点进行定位和效应分析，构建了包含32个RAPD标记的连锁图，检测到控制17种产肉性状的35个QTL，并定位于5个连锁群的13个标记区间。 ② 猪的肉质性状基因定位 主效基因：氟烷基因；酸肉基因。 肌肉脂肪、候选基因定位：肌纤维、嫩度、pH、肉色、多汁性、失水率等定位。 ▲ 猪氟烷基因（Hal） 灰白水样肉（PSE）（pale，soft，exudative）是猪肉的缺陷，氟烷测验研究发现猪PSE影响主效基因——氟烷基因（Hal）即是位于猪6q1.1~1.2的RYR1基因（候选基因），是由于正常显性HalN突变→隐性Haln。 ▲ RN基因（RN）：酸肉基因 法、德、瑞典科学家将RN基因定位于chro 15，其周围有多个微卫星标记。 ▲ 猪肌内脂肪（intramuscular fat, IMF）基因定位 IMF与肉质正相关，影响嫩度、风味、多汁性，只有在宰杀时才能测定到，故标记对MAS有意义，很昂贵的研究费用。 IMF的候选基因有2个： ★ 心脏脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP），定位在chro 6并测序（荷兰Gerbens）。 ★ 脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因（A-FABP），猪的A-FABP也被荷兰Gerbens等分离测序，定位在chro 4。 发现A-FABP基因在人、小鼠和大鼠间高度保守。 IMF的统计定位： 荷兰Janss等的研究结果： ★ 一个主基因影响IMF含量，还可作用于易切值和失水率，称MI基因； ★ 另一个主基因影响BFT，烹调损失和两个pH值，均为隐性； ★ 用基因组扫描法，揭示IMF含量QTL位于chro 2，4，6，7上。 ▲ 肌纤维的基因定位。 ▲ 肌肉的嫩度和多汁性。 ▲ 失水率、pH值及肉色。 三、动物资源的遗传多样性分析 与过去广泛研究的形态学标记、细胞学标记、血型、酶、激素及代谢物等遗传标记相