采用LCTOF-MS快速分析真菌粗提物中的-真菌鉴定的新方法.docVIP

采用LC/TOF-MS 快速分析真菌粗提物中的次级代谢产物－真菌鉴定的新方法 引言 从食品安全的角度考虑需要鉴定从农产品中分离出来的霉菌（真菌），因为它们可能是食品中霉菌毒素污染的潜在来源。鉴定真菌的传统方法以经典的真菌学为基础，包括真菌在不同培养基上的培养和随后依据形态学和生长行为特征进行的分类。然而，这种分类鉴定耗时且带有一定的主观性，并依赖于真菌学家的经验和技艺。此外，这种分类对实际次级代谢产物谱仅能提供参考性证据，因为这些判断是以前人研究的特定种类真菌的次级代谢为基础。这种经验方法由于同种真菌既可能产生毒素又可能不产生毒素这一事实的存在而使人更加困惑，也就是说有些真菌容易产生霉菌毒素，而另外一些与其无差异的同种真菌从遗传上就不能产生毒素。因此，仅靠对真菌物种进行分类不能真正判断霉菌毒素的产生。过去，直接分析真菌培养基以确定是否存在霉菌毒素必然包括“目标”分析，不可避免地假定能找到那种毒素，而LC/TOF-MS 提供了一种可能的新方法用于研究真菌产生毒素的行为。即使从基质中有效提取出的毒素表现出较大的极性差别，TOF-MS 的特异性意味着不需要再进行任何样品纯化。而且，也不需要进行目标分析，因为仪器能测定在液相色谱分离中检测到的任何组分分子离子的精确质量数，这些组分可以通过检索数据库中相关次级代谢产物的精确质量数得以鉴定。? 本文介绍从培养真菌中提取次级代谢产物的合适条件和随后进行LC/TOF-MS 分析的条件。方法学验证采用在各种培养基中添加黄曲霉毒素、赭曲霉素A、单端孢霉烯、玉米赤霉烯酮和腐马素毒素，从低浓度基质中提取具有良好的回收率，随后通过检索比较数据库中465 种次级代谢产物进行鉴定。本方法已应用于从培养物收藏单位获得的一种青霉菌和6 种曲霉菌的代谢物鉴定，其次级代谢产物已与预测的毒素谱进行了比较。 实验部分所有分析工作均使用Agilent 6210 TOF-MS 与Agilent 1200 系列HPLC联用完成。霉菌毒素和其它真菌代谢物的分离也采用HPLC 系统完成（包括真空脱气机、自动调温进样器、二元泵和DAD检测器），色谱柱为反相C18 柱（ZORBAX Eclipse XDB 100 x 2.1 mm，1.8 μm)。TOF-MS配置了双喷雾器电喷雾源、可以连续导入内标参比标样。仪器的扫描范围对所有样品均为m/z 100 ~ 1,000，扫描速度在9,429 transient/scan下为1 cycle/sec。此质量范围能够涵盖两个内标参比标样产生的离子，即m/z 121.0508 和922.0097。进样体积5 μL。HPLC 分析使用的流动相为乙腈和2 mM的乙酸铵的1% 甲酸水溶液，流速为0.3 mL/min。梯度洗脱从15% 乙腈开始经20 分钟增加到100% 乙腈。色谱柱采用100% 乙腈冲洗5 min，每次进样前平衡5 min。紫外光谱采用二极管阵列检测器获得，每0.4秒从200 nm扫描到700 nm，分辨率为4 nm。TOF-MS 的优化条件列于表1。采集的数据采用具有精确质量数应用功能的Analyst-QS 软件处理。465 种霉菌毒素和其他真菌代谢产物数据库根据参考文献数据采用Excel 创建[1,2]，这样创建的文件容易用于Agilent 软件的检索功能。 　　 真菌提取已鉴定的A. paraciticus (NRRL 2999)分离菌来自USDA菌种保藏机构，分离菌A. flavus(200198)、A. ochraceus (200700)、A. oryzae (200828)、A. niger (200807)、A. fumigatus (200418)和P. citrinum (501862)来自TüBITAK Mamara 研究中心的菌种保藏部门。将真菌接种到分别装有麦芽提取物琼脂(MEA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、和酵母提取物蔗糖琼脂(YES)培养基的陪替氏培养皿中。在25 °C 下培养7 至14 天，可以在培养基表面观察到典型的真菌菌落大量繁殖生长。取样采用软木塞钻孔器垂直切下两个直径6 mm包含真菌菌丝体和其下培养基的塞状样品。将塞状样品转移至5 mL的一次性旋盖瓶中。提取条件在文献方法[3,4]的基础上进行改进。一个样品依次采用2 mL含1%甲酸的乙酸乙酯和2 mL异丙醇提取两次；另一个样品依次采用2 mL含1%甲酸的乙酸乙酯和2 mL乙腈提取两次，随后旋涡混合1 min 并进行总计30 min 的超声振荡。提取物过滤后用氮气吹干。两个样品的残余物溶于1 mL甲醇，超声振荡10 min，经0.2 μL 一次性过滤器过滤后用于HPLC分析。 结果与讨论LC/TOF-MS 条件优化 最重要的仪器参数，包括毛细管电压、喷雾器压力、干燥气、气体