第五章 NMR蛋白质结构解析.pptVIP

第五章 蛋白质结构解析 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析 1、NMR基本原理 NMR的基本原理 原子核的自旋运动 原子核具有一定的质量和一定的体积，可以把它看成是一个接近球形的固体。实验表明，大多数的原子核如同陀螺一样，都围绕着某个轴作自旋运动。例如，常见的 H1和C13核等都具有这种运动。 2、核磁共振中几个常用的参数 化学位移：把由于原子和分子中核的化学环境不等价而引起拉摩尔进动频率的变化叫做化学位移。 自旋自旋偶合：由于分子内部原子核的磁相互作用引起的通过电子壳层传递的，使分子中的核在电子壳层中感应出一个磁矩，然后再作用到被侧核上，从而改变了被侧核的共振条件，使谱线分裂为多重线。这种谱线的精细结构也称为自旋—自旋分裂。 驰豫时间：核自旋系统由于受到外界作用离开平衡状态后，能够自动地向平衡状态恢复，即从高能级恢复到基态的过程称为弛豫过程。弛豫现象是由于物质相互作用而发生的，弛豫时间是描述这种相互作用的参数。 核磁共振波谱仪原理 两个磁铁产生均匀、稳定的静磁场Ho，两磁极间放样品管，并有一机械旋转装置，可使样品管在两极间旋转。样品管外面是射频振荡线圈，它被安装在与外磁场Ho垂直的方向，可发射固定频率的无线电波。该磁场的有效部分是一个强度为H1绕着H0旋转的磁场，当射频频率等于核的进动频率（ω=γH0）时，发生共振。把得到的信号送到射频接收器，经射频放大器放大，通过相位调节，得到所需要的纯吸收型或色散型信号，并由记录器给出谱图。 生物NMR常用实验技术 同核相关谱（COSY）用来鉴定具有偶合关系的质子对。其形态为矩形图谱中间分布着一些同心圆，实际上是一些吸收峰的等高线截面图，称为交叉或相关峰，表示相应质子间存在着偶合关系。 双量子滤波相关谱（DQF-COSY）一般采用所谓时间相位比例增量法(TPPI)记录谱图，即所谓的相敏COSY谱。其每一个交叉峰都由若干个正负相间的信号组成，其所构成的精细结构包含有质子间复杂的偶合关系和偶合常数等进一步的信息。 全相关谱(TOCSY) 又称 HOHAHA谱，在它的脉冲序列中包含有自旋锁定的步骤，能将一个自旋体系的全部自旋相关联。 NOE相关谱（NOESY）用于鉴定质子在空间的相互接近。空间相互接近的质子之间，会产生交叉驰豫的现象，即NOE效应。 ROESY谱 是在一种旋转坐标下测定的NOESY谱 。 NMR测定蛋白质三维结构的基本过程 适用范围——分子量 分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加） 同核二维1H谱：80氨基酸 异核多维（二维、三维）： 常规三共振（1H,15N,13C） 200氨基酸 氘标记，特殊标记 已报道有700氨基酸 同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备 标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备 常规样品 浓度：毫摩尔每升 500uL 10kDa ? 5毫克每样品 均一 没有聚合 水溶液（10%重水锁场） pH7.5 常用缓冲体系：Tris-HCl, 磷酸盐，醋酸盐 稳定性：室温下大于一周 NaN3 蛋白酶抑制剂 NMR研究蛋白质结构实验步骤 研究样品的选择与制备： 1. 样品选择：分子量、样品量、溶解度、样品纯度、稳定性 2. 核磁样品管：选择、清洗、干燥、样品体积等。 3. 样品制作：浓缩方法 、脱盐和缓冲剂交换 、水-重水的交 换 、过滤方法 、样品的脱气 等。 4. 样品参数：pH值、离子强度、缓冲液种类、溶剂浓度、表面活性剂的增溶作用、样品温度、化学位移参考物。 5. 防止样品污染：顺磁性物质（金属）、微生物污染 NMR数据的采集与数据处理：中心频率、谱宽、数据点、接收器增益设定和水峰抑制。 质子自旋系统的识别与信号归属； 决定结构约束因子和分析规则二级结构； 计算出符合约束因子的三维结构和进行结构精修； NMR在生物应用中的优越性 被测的生物样品不被破坏； 能测定与生物状态接近的溶液中 生物高分子的结构与浓度； 研究生物样品的动力学过程及其 相应的能量变化规律； 能获得多种参数，为分析生物分 子结构提供多种信息； 能研究生物高分子构像的动力学； 可测定多种原子核，如，H1、 C13、P31、N14等。 * * 一、核磁概述 瑞士科学家发明了“利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构法”。 这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析。原理可以用测绘房屋的结构来比喻，首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据此就可以推知房屋的结构。 维特里希选择生物大分子中的质子(氢原子核) 作为测量对象,连续测