蛋白质组学研究的技术体系介绍-中科新生命.PDFVIP

蛋白质组学研究的技术体系介绍 作者：ATP 蛋白质组学的发展和其技术的发展是紧密联系并相互作用的，一方面蛋白质组学的发展依靠技术进步的推 动，另一方面蛋白质组学研究本身反过来又促进了技术的突破。这些支撑蛋白质组学发展的技术除了包括 在蛋白质组学产生以前就出现了的双向凝胶电泳和生物质谱技术以外，也包括蛋白质组学发展过程中出现 的一系列定量技术和数据分析方法。到目前为止，蛋白质组学技术已经成为一个完整的系统，主要分为四 大类 ：第一类是凝胶和非凝胶的蛋白质组分离技术；第二类是基于生物质谱技术的蛋白质组学鉴定技术； 第三类是蛋白质组学定量技术；第四类是基于生物信息学的蛋白质组学数据的分析处理技术。正是由于建 立了如此丰富全面的技术系统，蛋白质组学的研究才能在短短的十几年间取得飞速发展。下面对蛋白质组 学技术及其优缺点予以具体介绍。 1. 蛋白质组学分离技术 在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。如何实现对复杂的蛋白质样品或者其酶解产物进 行有效的分离，是对样品做后续鉴定的先决条件。目前蛋白质组学常用的分离技术主要有两种类型 ：一是 凝胶技术，主要包括双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis ，2-DE ）技术以及后来出现的双 向荧光差异凝胶电泳技术（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis ，2D-DIGE ）； 二是非凝胶技术，主要是色谱(Liquid Chromatography ，LC )技术，尤其是高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC ）和多维液相色谱（Multi-Dimensional Liquid Chromatography ，MDLC ）。 1.1 双向凝胶电泳 传统的双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis ，2-DE ）技术由O’Farrell 和 Klose 等人于 1975 年建立。第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing ，IEF ），使蛋白质根据等电点不同进行分离，第 二向为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ，SDS），即将等电 聚焦后的胶条放在 SDS上再根据蛋白质分子量不同进行电泳分离。由于具有高分辨率的特点，双向 凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。 现在的双向凝胶电泳技术第一向利用固相 pH 梯度（Immobilized pH Gradient ，IPG ）等电聚焦技术， 具有上样量大、分辨率高、重复性好等优点，并且可以提供蛋白质的等电点（pI ）和分子量（MW ）数值 信息，有助于蛋白质的鉴定，而且双向凝胶电泳胶上常见的 isoform 多是蛋白质翻译后修饰的结果，对于 这些蛋白质点的分析有助于了解对蛋白质功能影响重大的翻译后修饰。但是双向凝胶电泳技术本身也存在 一些难以克服的缺陷，主要表现在两个方面 ：第一，双向凝胶电泳对蛋白质的分离受到蛋白质丰度、等电 点、分子量和疏水性等的限制。对于低丰度蛋白质，由于上样量的限制不能达到足够质谱鉴定需要的量； 对于极大蛋白质(相对分子质量200 kDa)、极小蛋白质(相对分子质量8 kDa)、极碱性蛋白质和疏水性蛋 白质(膜结合蛋白质和跨膜蛋白质) ，都难以进行有效分离分析。第二，双向凝胶电泳操作费时费力，难以 实现和质谱的直接联用，不易自动化。 图 1. 双向荧光差异凝胶电泳 目前在传统双向电泳技术的基础上发展出的双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis, 2D-DIGE) (图 1) ，采用专有的荧光染料与多重样本和图象分析的方法,在 同一块胶上可同时分离多个由不同荧光标记的样品，并以荧光标记的样品混合物为内标，对每个蛋白质点 和每个差异都可以进行统计学可信度分析，从而具有良好的重复性和较高的准确率。另外，由于荧光染料 的使用，使得双向荧光差异凝胶电泳具有高灵敏度的特性，能够满足高通量差异蛋白质组学研究分析的要 求。 双向凝胶电泳作为蛋白质组学最经典的技术手段，随着本身的的不断