多花木蓝盐胁迫的生理响应试验方案教案.docxVIP

多花木蓝盐胁迫的生理响应试验方案材料和样品：多花木兰种子、NaCl、完全培养液（硝酸钙1克、磷酸二氢钾0.25克、硫酸镁0.25克、氯化铁0.25克、氯化钾或硝酸钾0.25克）、蒸馏水。溶液培养皿设置：设置5组不同培养条件，选择饱满、均匀、外观良好的种子，放入溶液培养皿中，每皿30粒，分别加入相同量的完全培养液及6ml不同浓度的NaCl溶液（浓度梯度：0g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、12 g/L），编号1、2、3、4、5，第1组为对照组，实验中每组设3个重复试验。将培养皿置于温室中培养，每天下午3时适当补充蒸发水分，以维持盐分浓度的稳定。培养相同时长，待多花木蓝长出幼苗后，分别测定5组多花木蓝幼苗的各项指标。一、多花木蓝幼苗生长特性指标测定生长指标测定：记录每组植株成活数量，计算成活率；用直尺和游标卡尺测量株高、茎粗、最大侧根长。根系活力的测定：TTC法材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培的多花木蓝根系。（二）仪器设备：分光光度计；分析天平（感量0.1mg）；电子顶载天平（感量0.1g）；温箱；研钵；三角瓶50ml；漏斗；量筒100ml；吸量管10ml；刻度试管10ml；试管架；容量瓶10ml；药勺；石英砂适量；烧杯10ml、1000ml。（三）试剂：1）乙酸乙酯（分析纯）；2）次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末；3）1%TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100ml，用时稀释至各需要的浓度；4）磷酸缓冲液（1/15mol·L-1，pH7）。5）1mol·L-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml；6）0.4mol·L-1琥珀酸：称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、实验步骤（1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取5组根尖样品各0.5g，每组取三次，分别编号11、12、13，21、22、23，31、32、33，41、42、43，51、52、53，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做5个空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲腙。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算四氮唑还原强度（mg.g-1根鲜重h-1）＝四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h）叶绿素含量测定：分光光度法材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜的多花木蓝叶片。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。三、实验步骤1. 取新鲜多花木蓝叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 称取5组剪碎的新鲜样品各0.2g，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649Cb=24.96A649－7.32A665据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数