食品中动物源成分牛肉成分PCR鉴别实验标准操作程序.docxVIP

食品中动物源成分牛肉成分PCR鉴别实验标准操作程序1 目的：保证食品中动物源成分牛肉成分PCR检测结果准确、可靠。2 适应范围：食品中动物源牛肉成分PCR定性，样本类型生、熟肉制品。3 试剂、耗材来源：商品试剂盒，PCR专用耗材；质控物：ddH2O做空白,阴性、阳性对照来源于试剂盒。4 仪器：BIO-RAD T-100 PCR仪；BIO-RAD电泳装置；BIO-RAD凝胶分析成像系统；生物安全柜；高速离心机(≤16,000g)；微量移液枪(0.5-10μL、10-20μL、20-200μL、1000μL)；5 标准操作: 5.1样本的处理：取样应尽量采取肌肉组织。对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织捣碎机中进行均质成糜状，充分混匀。取适量充分混匀的样品，放入研钵中，液氮研磨。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化5.2试剂配制0.5xTBE:取10ML50x的TBE加灭菌超纯水稀释至1000ML，摇匀备用。DNA提取、PCR反应体系、上样缓冲液等试剂均为商品试剂 5.3、DNA提取DNA提取试剂盒操作标准说明取20-50㎎动物组织，液氮研磨成细分，转入有180μL组织裂解液的1.5ml离心管。大口径枪头吹打混匀。加入20μ蛋白酶K（20㎎/ml）立即漩涡混匀，55℃水浴3小时或至组织完全消化，期间轻柔振荡几次帮助裂解。加入20μL RNase A(25㎎/ml)溶液去除RNA。用一个1ml不带针头的一次性注射器抽打裂解物2-3次。加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，立即漩涡混匀。13，000rpm离心5分钟，将上清转入吸附柱AC中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。加入500μL抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃废液。加入500μL漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。将吸附柱AC放回空收集管，13,000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液，以免影响下游反应。取出吸附柱AC，放入干净离心管中，在吸附膜的中间位置加入100μ洗脱液EB，室温放置3-5分钟，12,000rpm离心1分钟，将得到的溶液重新加回吸附柱，12,000rpm离心1min。得到的DNA溶液4℃保存，若长期保存置于-20℃。5.4 PCR扩增 将得到的DNA 、空白、阴性、阳性质控与牛源PCR试剂盒中引物、Taq酶、dNTPs、PCR Buffer等按说明书操作，加于PCR反应管（加样在洁净区操作），每个反应体系做两个平行，上机；a.预变性：可用95℃，5min。 b.变性：一般用95℃，45s。 c.退火：65，30s。 d.延伸： 72℃，45s。 e.循环数：35个循环。 f.最终延伸：72℃，10min。 g.保存：4℃，时间设为∞。5.5电泳凝胶制备:称1.5-2g琼脂糖溶于100ml0.5xTBE溶液，煮沸，待冷至60℃左右，加入4μGold View，摇匀，倾入制胶板，冷却待用。点样:将PCR产物5μ与6xLoading Buffer1μ混匀，小心加入点样孔，一侧点样孔加DNA Ladder(100-1000bp)。电压5V/㎝，设为80V-100V。时间20-40分钟。5.6荧光成像电泳完成后，佩戴PE手套将凝胶置于托盘，置于成像处，关闭舱门，脱掉PE手套，点击鼠标，运行试验协议。成像完毕，带上PE手套取出凝胶，置于生物危害待处理区。6 结果分析:空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出实验判定有效。产物扩出对应条带暂定为阳性，未扩出为阴性(扩增片段358bp)。对阳性结果进行测序，同源性大于95%判定阳性。12、 支持性文件：（1）《肉与肉制品中牛源性成分核酸扩增检测试剂盒》说明书（由×××公司生产）（2）BIO-RAD扩增仪标准操作程序SOP（3）SN/T