(生物技术制药)2.基因工程制药-1.ppt

3.限制性酶谱分析法 将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1-2种RE酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。 * 中山大学药学院 张革 * 基因文库的应用 * 中山大学药学院 张革 * 4.cDNA文库法 cDNA（complementary DNA） 为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。 mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子； 在mRNA存在的3′末端的多A序列的核苷序列，外显子序列、先导序列以及后续序列等。 * 中山大学药学院 张革 * cDNA文库 指某生物某发育时期所转录的全部?mRNA，?经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典??cDNA??文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA?加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 * 中山大学药学院 张革 * (四）载体DNA与目的基因的连接 DNA分子体外重组： 连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。形成重组子（recombinant)的过程。 1.粘性末端的连接： 经双酶切获得粘性末端，用连接酶进行连接 2.平头末端的连接： 连接效率低，一般采用加尾法、接头法 3.连接效率： 目的基因与载体DNA的摩尔比大于1 * 中山大学药学院 张革 * 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 定向克隆 * 中山大学药学院 张革 * 问题： 如何加入合成接头？ * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ * 中山大学药学院 张革 * cDNA克隆的过程 * 中山大学药学院 张革 * （五）重组DNA导入宿主细胞 宿主细胞： 原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌链球菌 真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞 原核细胞的转化方法： 电穿孔转化法 化学转化法 * 中山大学药学院 张革 * 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) ◆转化 (transformation)： 以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程. ◆转染 (transfection): 以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程. * 中山大学药学院 张革 * 表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。 1.重组DNA导入大肠杆菌 * 中山大学药学院 张革 * 氯化钙转化法： 在基因克隆技术中，转化(transformation)特指质粒DNA或 以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。 是利用低温（0℃）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液 的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状 态，即感受态（competence）。 转染法： 如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染 机制导入宿主细胞。体外包装是将重组DNA分子与λ噬菌体 的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具 有感染力的λ噬菌体粒子。 * 中山大学药学院 张革 * 重组DNA导入酵母 酵母： 繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。 表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。 * 中山大学药学院 张革 * 酵母电转化法： 酵母用山梨醇处理，制备感受态细胞； 将线性化DNA、感受态细胞置于电转仪中，通过电击将DNA导入细胞； 电击后应立即加入冰冷的山梨醇溶液（是为了修复电击受损的酵母细胞，加入的越快越有利于细胞的恢复）。 * 中山大学药学院 张革 * 重组DNA导入链霉菌 链霉菌： 重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。 * 中山大学药学院 张革 * 原生质体转化法： 原生质体protoplast：人工条件下用溶菌酶