基于桃花瓣的cDNArAFLP分析体系的建立-江苏农业科学.PDFVIP

— ２０— 江苏农业科学　２０１４年第４２卷第５期 李　凡，沈志军，马瑞娟，等．基于桃花瓣的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ分析体系的建立［Ｊ］．江苏农业科学，２０１４，４２（５）：２０－２２． 基于桃花瓣的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ分析体系的建立 １，２ １ １ １ １ １ 李　凡 ，沈志军 ，马瑞娟 ，蔡志翔 ，焦　云 ，俞明亮 （１．江苏省农业科学院园艺研究所，江苏南京２１００１４；２．南京农业大学园艺学院，江苏南京２１００９５） 　　摘要：以桃为材料，研究了影响ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ反应体系的几个关键因素，建立了适宜桃的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ分析体 系，得到了较为清晰可辨的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ指纹图谱。结果表明，改良ＣＴＡＢ法提取的ＲＮＡ较完整，纯度较高；反转录 试剂盒形成的双链ｃＤＮＡ经ＥｃｏＲ 和Ｍｓｅ 完全酶切后，１６℃连接过夜；２０ Ｌ的体系中，连接产物２．０ Ｌ作为预扩 Ⅰ Ⅰ μ μ 增的模板，循环数为３０，预扩增产物稀释１０倍作为选择性扩增的模板，扩增结果较好。 　　关键词：桃；ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ 　　中图分类号：Ｓ６８５．９９０．２４　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１４）０５－００２０－０３ 　　ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ（ｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒ 提供的使用说明。（２）改良Ｔｒｉｚｏｌ试剂法：参照王红波等用于 ［１０］ ｐｈｉｓｍ）技术是Ｂａｃｈｅｍ等在ＡＦＬＰ的基础上发明出来的用于 牵牛花花瓣的提取方法 。（３）ＣＴＡＢ法：参考史宝胜等用 ［１］ ［１１］ ＲＮＡ指纹分析的方法 ，该技术是以ｍＲＮＡ反转录的ｃＤＮＡ 于紫叶李叶片的ＲＮＡ提取方法 。（４）改良ＣＴＡＢ方法：样 为模板进行的ＡＦＬＰ分析，具有稳定性高、灵敏度高、无需了 品材料置于预冷的研钵中，用液氮磨至粉末状；取约１ｇ样品 解序列信息等优点，已成为转录基因组学研究的重要工具和 置于 １０ｍＬ离心管中（已加６５℃预热的ＣＴＡＢ提取液４ｍＬ， ［２］ 寻找差异表达基因的有效手段 。ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术目前已 ２％８０ Ｌ疏基乙醇），混匀，６５℃水浴 １０ｍｉｎ；加入４ｍＬ氯 μ 经在植物发育、逆境胁迫反应以及植物生理调控等相关基因 仿－异戊醇（２４∶１），混匀，１５℃，１００００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，吸取 的分离方面得到了广泛应用，已从白菜、玉米、小麦等植物中 上清液，重复 ３次；往上清液中加入 １／５体积的 １２ｍｏｌ／Ｌ ［３－５］ 分离和克隆出多个有价值的基因 。该技术流程包括 Ｌｉｃｌ，４℃放置过夜；次日，４℃，１００００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，倒掉上 ＲＮＡ的提取与双链 ｃＤＮＡ的合成、酶切、预扩增与选择性扩 清液，吸收残余上清液，加入４００ Ｌ的ＳＳＴＥ，少量亚精胺溶 μ 增、扩增产物的检测等步骤，技术难度较大，过程相对繁琐，要 液，沉淀２ｍｉｎ后反复吸打，将液体吸出，加入 ４００ Ｌ的氯 μ 求在进行ＡＦＬＰ分析前先建立合适的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ体系。目 仿－异戊醇（２４∶１），混匀，４℃，１００００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ，吸出上 前，国内