[研究生入学考试]吉林大学生命科学学院生物化学4.ppt

多肽的双缩脲反应(Biuret reaction)是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。 2. 多肽链的命名 ? L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val ? ? L-Orn L-Orn ? ? L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu ? 短杆菌肽S(环十肽) ? 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如:鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。 B. 蛋白质的纯化方法 根据溶解度不同纯化; 根据分子质量（大小）纯化; 根据电荷不同纯化; 根据蛋白质与其它物质的相互作用纯化; 1. 根据溶解度不同纯化 (1) 等电点沉淀法 (2) 盐溶与盐析 W=505（S2—S1）/（1—0.285S2） V = 100（S2—S1）/（1—S2） (3) 有机溶剂沉淀法 (4) 加热沉淀法 2. 通过分子质量（大小）纯化 (1) 凝胶过滤层析（分子排阻层析) (2) 膜分离技术（层析及超滤法） (3) 密度梯度离心法 3. 根据电荷不同纯化 (1) 离子交换色谱法： (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） (3) 等电聚焦电泳（IEF）： (2) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺; 交联剂：TEMED四甲基乙二胺 （N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine）; 引发剂：过硫酸铵； 变形记：SDS十二烷基磺酸钠； 还原剂：β-巯基乙醇; 蛋白质类型 ■ 离子取代优先顺序 ++ + + + + + + + + + + + + + + + + 电荷高者 离子大者 浓度大者 离子交换层析类型 强酸型：磺乙基、磺丙基 阳离子交换树脂 中酸型：磷酸基 弱酸型：羧甲基 强碱型：三乙基氨基乙基、 阴离子交换树脂 二乙基（2—羟丙基）—氨基乙基 中强碱型：二乙基氨基乙基 弱碱型：氨基乙基、对氨基苯甲基 蛋白质纯化常用的离子交换剂 蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化的物质不易被破坏。 纤维素类：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。DEAE-Sephacel 是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。 蛋白质纯化常用的离子交换剂 葡聚糖系离子交换介质：主要以Sephadex系的产品为主，它是在Sephadex G25及G50两种凝胶过滤介质上引入功能基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代的BioProcess凝胶所代替。 琼脂糖系（agarose)：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的多种离子交换剂。其中，新一代BioProcess系列凝胶，具有流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复使用，是目前使用最多的离子交换介质。 Test-tube methods for selecting ion exchange conditions (2) SDS-Polyacrylamide gel  electrophoresis （SDS） Monomer：acrylamide，Methylenebisacrylamide; Accelerator：TEMED （N,N,N’,N’-Tetramethylethyl