[生物学]讲稿-6-1.ppt

原位杂交包括取材及材料预处理、固定细胞、细胞的RNase酶解及染色体变性、杂交、检出五个程序。探针的制备与印迹杂交相同。在取材及材料处理上，因要观察的是细胞内的染色体，有丝分裂中期的染色体。取材时应取便于观察染色体的材料，如植物的根尖、茎尖、幼叶、幼小的子叶、茎形成层、居间分生组织、愈伤组织、花蕾、花粉、胚乳等，还要用化学或物理的方法对材料进行预处理，阻断纺锤体微管的形成，使有丝分裂停滞于中期，这样可以得到大量的供实验用的染色体。 目前原位杂交技术存在两个问题： 一是灵敏性不高。 二是有时会出现非特异性杂交。 PCR-Southern杂交是一种近年来开始使用的检测外源基因整合的方法。该方法先对被检材料进行外源基因的PCR扩增，然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。 5 PCR-Southern杂交检测 1）转基因植株PCR—Southern杂交检测 （1）样品设置 为确保检测的真实性，除被检样品外，实验中应设置三个对照： ①空白对照：无任何DNA模板(反应体系中不加入任何模板DNA，其它试剂相同，主要检测反应体系中有无DNA污染)。 ②阳性对照：以外源基因的质粒载体DNA为模板。 ③阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。 ④被检样品：以不同克隆系的基因组DNA为模板。 （3）印迹及杂交 将扩增产物电泳后的凝胶碱变性处理后转移到固相膜上，以目的基因为探针进行杂交。操作程序和方法与Southern杂交相同。 （2）PCR扩增及产物电泳 （4）杂交结果 凝胶中的特异性扩增条带能发生杂交。非特异性扩增条带不发生杂交，所以阳性对照应产生杂交带，非转化植株无杂交带。各被检植株样品中出现杂交带的可被确定为转基因的。 （5）PCR—Southern检测中应注意的问题 初次进行PCR扩增时易出现如下问题： ①没有得到特异性扩增产物。可能的原因有酶变性失活、模板变性不充分、引物不正确或试剂失效。出现这种情况时，可先增加预变性时间，若仍无效，则应换用新试剂。 ②电泳谱上无清晰的扩增条带出现，而是呈降解片状。出现此种现象主要原因是模板过量，应减少模板及酶用量。 ③产物特异性不强。应减少引物量及提高退火温度、减少Mg2+浓度。 ④出现引物二聚体条带。首先检查引物是否存在3’端互补的问题，如果无此问题，应减少引物量及循环次数。增加原始模板量及退火温度。 ※ 实验操作中要注意防止DNA污染，那怕是痕量的也要防止。操作时要戴一次性的手套。所用的器皿，离心管、吸头等均应使用新的，并要经过高压灭菌。盛有PCR试剂的小离心管打开前应用离心机轻离一下，使试剂沉到管底，这样做可防止取液时手套、移液器对试剂的污染。如有条件，整个操作都应在超净工作台中进行。 ※实验结果的分析要慎重，由于PCR的灵敏度极高，同时植物基因组又大又复杂，对扩增出的条带要进行认真的分析，以区分出特异性扩增及非特异性扩增。 （二）外源基因表达的检测 基因表达检测分为两个水平： 一是在转录水平上对特异mRNA的检测。主要方法是Northern杂交，其中包括斑点杂交及印迹杂交； 二是在翻译水平上对特异蛋白质的检测。检测方法有三种：①生化反应检测法：主要通过酶反应来检测；②免疫学检测法：通过目的蛋白(抗原)与其抗体的特异性结合进行检测，具体方法有免疫沉淀法、酶联免疫吸咐法(ELISA)及Western杂交；③生物学活性的检测。上述方法中Northern杂交及Western杂交又属于分子杂交检测。 1 Northern杂交 同Southern杂交一样，Northern杂交又分为斑点杂交及印迹杂交，斑点杂交只需将RNA样品点样在固相膜上直接与探针杂交，而Northern印迹杂交则需先将从试材中提取的总RNA或mRNA样品进行电泳分离然后转移到固相膜上，再与探针杂交。斑点杂交只能鉴定外源基因是否转录，而印迹杂交可对外源基因的转录情况进行较详细的分析，如RNA转录体的大小及丰度等。 Northern杂交程序也分为三大部分： ① 植物细胞总RNA的提取， ② 探针的制备, ③ 印迹及杂交。 * 第五章：转基因体的鉴定验证 ? 外源基因是否进入受体细胞？ ? 进入受体细胞的外源基因是否整合到染色体上？ ? 整合的方式如何？ ? 整合到染色体上的外源基因是否表达？ 这一系列的问题仍需回答，只有获得充分的证据后才可队定被检的材料是转基因的。 外源基因整合的分子生物学鉴定主要有PCR扩增、PCR-Southern杂交、 Southern杂交以及Southern原位杂交和FISH等。 一、外源基因整合分子生物学鉴定 1 利用PCR扩增检测外源基因整合 ※ 以被检植株DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增。 ※ 琼