[生物学]荧光定量PCR技术-适用版.ppt

It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. It’s very important that these are set correctly, as the data can suffer if they’re not. ΔΔCt法计算示例 最后，计算出倍数关系2 –ΔΔCt。 相对标准曲线法 每对引物做一条相对标准曲线 相对标准曲线法 计算示例 表示倍数差异 实验内容 实验：小麦中Cu/Zn-SOD基因含量的相对定量测定 实验材料：小麦根和叶 目的基因： sod 内参基因：actin 相对标准曲线：6个梯度，2倍稀释。 样品：4倍稀释 实验内容 按PCR反应样品数计算所需各试剂的体积数，加入以下各反应组分（目的基因与内参基因的样品各做三个重复）。 2×SYBR? Premix 10μL 上游引物 0.4 μL 下游引物 0.4 μL ROX 0.4 μL dd H2O 7.8 μL cDNA模板 1 μL 实验内容 设置程序并运行 Segment 1：预变性 95℃ 30s ； Segment 2：PCR循环95℃ 5s；60℃ 34s；40 cycles； Segment 3：Dissociation Curve 分别记录各管反应的Ct值。 实验内容 计算小麦幼苗叶中Cu/Zn-SOD相对于根的表达量： 1. 用内参actin基因的Ct值归一Cu/Zn-SOD基因的Ct值： ΔCt根= Ct（根，Cu/Zn-SOD）- Ct（根，actin） ΔCt叶= Ct（叶，Cu/Zn-SOD）- Ct（叶，actin） 2. 用校准样本的ΔCt值归一试验样本的ΔCt值： ΔΔCT=ΔCt叶-ΔCT根 3. 计算表达水平比率： 叶中Cu/Zn-SOD的相对表达根中/ Cu/Zn-SOD的相对表达 =2–ΔΔCt 常见问题分析 1.扩增效率为什么达不到100% 主要原因： 样品不纯 扩增产物太长 没有选择合适的引物退火温度 引物的设计有