[自然科学]杂交技术.ppt

第三节 核酸分子杂交技术 第四节 蛋白质杂交技术 复性的（速度）过程的影响因素： ①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。 ②DNA的分子量：大分子量的DNA扩散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很难形成正确配对，因此复性速度较慢。 ③温度：温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；而温度过低，碰撞机率减少，易形成局部错误配对，适宜的温度是较Tm值低15℃～25℃。 ④离子强度：离子强度过低，不利于复性 ⑤pH值：pH值在5～9范围内，不影响复性速度，过低或过高则影响。 ⑥DNA分子的复杂性：DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。 （3）杂交体系的建立要考虑以下几因素 ①DNA浓度：DNA浓度越高，复性速度越快。加入足够的DNA并尽量减少杂交的体积，一般以每平方厘米滤膜面积加50～100μl杂交液为宜。 ②DNA探针的长度：在杂交过程中，待测DNA固定在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越慢，变性越慢。因此探针的长度不宜过长，一般以10～50bp。 ③离子强度：离子强度对变性影响较大。一般常用5×或6×SSC（1×SSC为0.15mol/L Nacl和0.015mol柠檬酸钠）。 ④温度：温度对于杂交（复性）反应的快慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的因素。 一般认为杂交温度为：68℃（不含甲酰胺）；当含50％甲酰胺时，在42℃进行杂交。 洗膜温度一般认为55℃～65℃。 对于寡核苷酸探针的杂交温度，应根据下列公式推算： Tm=4℃×GC＋2℃×AT 杂交温度一般比Tm值低5℃，55℃（20bp) ⑤杂交时间：一般应为Cot1/2的1～3倍。 Yz 小时/Cot1/2＝ ×2 5×10X Co＝单链DNA浓度，t1/2＝反应一半的时间 Y为探针DNA的复杂性，即片段大小（Kb） Z为杂交体系的体积(ml)。 经验杂交时间8～16h，过夜。 ⑥减少或抑制非特性杂交。一般在杂交前先进行预杂交，以便将非特异性DNA位点封闭，同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。 ⑦促进杂交反应速度：硫酸葡聚糖(dextran sulfate,Mw 500000)能促进DNA链间的缔合，其微粒表面可吸附DNA探针分子，从而使DNA接触面积增大，有利于杂交反应，促进杂交反应速度。 如10％硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提高10～100倍。 ①预杂交：将膜放在预杂液中，即不放探针，预杂交液中主要含Dehardt液和鲑鱼精DNA，主要是封闭膜上非特异性的杂交位点。 ②杂交：杂交液中除含封闭物质外，还含有10％硫酸葡聚糖和探针。探针如果是双链DNA，则需要进行变性处理。温度68℃（不含甲酰胺），42℃（含50％甲酰胺），杂交时间：8～16h过夜。 （4）杂交操作步骤 ③洗液：将膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针从膜上洗去的过程。由于非特异性杂交的杂交体稳定性较低，解链温度较低，而特异性杂交体由于稳定而保留在滤膜上。 注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液。离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温～37℃～65℃）。即逐渐增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，为下一步反应（检测）做好准备。 3．杂交信号的检测 ⑴放射自显影：探针标记了放射性核素，如32P、35S、125I或131I。 其具体方法是：在暗盒里将杂交后的滤膜放在暗盒里的X光片上，盖上暗盒，置－70℃曝光一定时间。 经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点，根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与探针相应序列及大小。 ⑵显色反应：探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特异性底物存在的情况下，可发生显色反应。根据显色反应斑点大小判断结果。 A B C 酶+底物 显色 探针 标记物 (地高辛) 抗体 常用的酶 碱性磷酸酶： 作用底物：BCIP（5-溴-4-氯-4-吲哚磷酸） NBT(硝基蓝四氮唑)。 显色过程：碱性磷酸酶 → BCIP → 脱磷，产生H+ → NBT还原 → 紫色化合物。 辣根过氧化物酶（HRP）： 常用的底物： DAB（二氨基联苯胺），红棕色，有致癌性。TMB（四甲基联苯胺），产生蓝色，无致癌性。 ⑶化学发光反应 与显色反应基本一致，只是酶（HRP碱