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无菌检查法 2005版 中国药典 福州 一·基本定义 无菌检查是检查要求无菌的药品.医疗器具.原料.辅料.以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。 符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。 二·环境要求 环境洁净度10000级和局部洁净度100级 一般要求 18~26℃ 45％~65％ 例行消毒处理 洁净度检查 三·仪器及用具 无菌室内常备器具 恒温培养箱及生化培养箱 离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等 玻璃器皿 无菌衣，裤，帽，口罩 除菌滤器及滤膜 四·培养基 一般采用商品脱水培养基 洁净玻璃器皿 纯水 培养基的pH应符合规定 分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2小时内最佳）进行灭菌处理 培养基的储存 培养基的用量 培养基的适用性检查 培养基的无菌性检查 培养基的灵敏度检查 培养基的灵敏度检查 硫乙12ml，9支，4株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养3d(原5天)。 改良马丁9ml，5支，2株菌，各1ml，每种培养基各接种2支（原3支），另1支培养基空白对照。培养5d。 结果判定 空白管培养基无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判灵敏度检查合格。 （原3支管有2管生长，合格。） 五·菌种及菌液制备 菌种的保藏和传代 甘油冷冻管保藏法 斜面低温保藏法 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 菌液制备 一般当日使用 金葡·铜绿的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h 黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基中， 20～25℃培养5～7d 稀释液、冲洗液及其制备法 ①0.1%蛋白胨水溶液 蛋白胨 1g, 加水1000ml, 加热使溶，过滤，调pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。冲洗液用。 ②pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 KH2PO4 3.56g，Na2HPO4 7.23g，NaCl4.3g, 蛋白胨 1g, 加水1000ml, 加热使溶，过滤，分装，灭菌。 ③聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液 蛋白胨1g, 聚山梨酯10ml，水1000ml, 加热使溶，过滤，调pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。用于水溶性供试品的无菌检查。 ④聚山梨酯80氯化钠-蛋白胨缓冲液 聚山梨酯80 10ml,KH2PO4 3.56g，Na2HPO4 7.23g，氯化钠4.3g，蛋白胨1g，水1000ml，加热使溶，过滤，分装，灭菌。用于水溶性供试品的无菌检查 六·方法验证试验 检验方法必须验证 薄膜过滤法验证试验 直接接种法验证试验 判断 增订： 方法验证试验 当供试品为新的产品或供试品的检验条件发生改变时，应进行方法验证试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。 直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8支，分别接入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液1ml(含菌小于100 cfu)各两管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。 与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量；增加培养基的用量；使用中和剂如?-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80等；更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行验证试验。 验证试验可与供试品的无菌检查同时进行。 供试品抽验量和检验量 检验数量