盘古基因TopFast-pACK4a快速克隆试剂盒.docVIP

TopFastTM快速高效克隆试剂盒 订货电话：0512传真0512技术资料： TopFastTM 快速高效克隆载体系列介绍 pACK载体系统采用拓扑异构原理达到快速高效。共有4种普通载体供选择,-B表示平端，-T表示T凸出。 载体名称 产品目录号 克隆区可用酶切位点 pACK4a-Bs CV4320 No, Simple pACK4a-Bm CV4420 Yes, Multiple pACK4a-Ts CV4120 No, Simple pACK4a-Tm CV4220 Yes, Multiple 使用前请务必仔细阅读说明书 试剂盒组成 (试用装仅包含载体3RXN) pACK4a Cloning Vector (30 ng/μL); PCR Control DNA Template (5 ng/μL); PCR Control Primer Mix (M13F M13R, 5μM). 产品说明 盘古基因科技的 TopFastTM pACK4a 系列为快速、高效、零背景克隆载体，其特点： ● 快速，重组连接仅需5～15分钟； ● 简单，无需IPTG，蓝白斑筛选只需加 X-gal； ● 方便，pACK4a系列的克隆区两侧分别安置了SP6 (与M13R-48同向)和 T7(与M13F-47同向)启动子序列，可方便地进行体外转录实验； ● 准确，盘古基因的 pACK 系列载体经过高技术优化，不同于传统方法制备的TOPO快速连接载体(如 TOPO系列，pEASY系列) 常会发生外源DNA插入非克隆区，导致测序失败或纠纷。 ● 大容量，易插入2kb以上大片段； ● 高效率，如果PCR引物5’-端加“A”保护，插入片段≥30ng/uL时，阳性克隆率接近100%； PCR 产物与载体的选择 1) 酶的选择：高保真DNA聚合酶的PCR产物无A碱基凸出，适宜pACK-B系列载体。普通Taq酶PCR产物3’有A碱基凸出，适宜pACK-T系列载体。 2) 引物要求：普通商业合成的PCR引物5’无磷酸，适合于pACK高速连接载体；如为磷酸化引物的PCR产物，连接反应前应当脱磷，或者采用盘古基因的pKAT系列“T-A”克隆或平端连接载体。 3) 产物条件：琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的量和纯度，如PCR产物有多条带或有弥散的非特异性扩增，建议凝胶回收目的片段后再作连接反应。 重组连接反应体系 在1.5 mL 离心管中依次加入管底： PCR 产物 1μL（≤4μL, ≥30ng/μL） pACK4a Cloning Vector 1μL 离心3秒，轻弹管底数下混合，再离心3秒，室温 (22℃-37℃) 反应5-15分钟。反应结束后，将离心管站立冰上， 如暂时不转化细菌，可冻存于-20℃。 连接反应注意事项: 1）对大于2kb的插入片段，37℃反应10-15分钟。 2）胶回收片段（1XTE、Tris或水溶均可），为保证克隆效率，室温或37℃反应10-15分钟。 连接产物的转化 1) 向连接产物加50μL化学感受态细胞（如电击转化，用专用感受态细胞100μL），轻弹混匀，冰浴20-30分钟。冰浴过程中切勿震动试管！ 2) 42℃热激60秒，然后立即冰浴2分钟。 3) 加入600μL SOC(或800uL LB)，37℃摇床，200-250 RPM，振荡孵育1小时。 4) 取8μL 500 mM IPTG(可省去)， 40 mg/mL X-gal 40～80μL均匀涂布于含Amp平板上，风干。 5) 取全部菌液，5000 rpm， 离心4 min，弃掉部分上清，保留100～150 μL，旋涡振荡器充分悬浮菌体（可减少双克隆菌落），取全部菌液涂板，培养过夜。 目标重组体的鉴定方法 1.菌落PCR法 1) 挑选单菌落至10 μL 无菌水中，涡旋混合。 2) 20μL PCR反应体系：取1μL细菌悬液作PCR模板、加2μL引物混合物(Primer mix)或自身的PCR引物, dNTP 2μL, 10 x Taq buffer 2μL, Taq酶1U, 水加至20μL。 3) PCR 反应条件：95℃预变性5分钟，94℃/30 秒，55℃/30 秒，72℃延伸,（ 根据片段的大小决定延伸时间，1kb以内≤60秒，1kb以上，每kb给予1.5-2 min），30个循环，补全延伸：72℃/5 分钟。1%琼脂糖凝胶电泳观察条带，条带与插入片段大小相符的，可视为阳性克隆。 2.克隆快鉴法(盘古基因 Cat# ID1001) 1).挑单菌落，放5mL含Amp的LB中摇菌12 hrs; 2) 每管取600μL置1.5mL EP管中，10,000rpm/1m; 3) 弃上清,以残留1