酶联免疫ELISA课件.ppt

3ELISA具体操作 1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断 3.1标本的收集和保存 未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（20－25℃）放置30－60min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37℃水浴20－30min，析出血清。 以3000r/min转速离心5－10min，使血清分离完全。 若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造成假阳性。 注意：（1） 要注意避免出现严重溶血、脂血标本。 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高，则其很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而产生非特异性显色。 脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。 注意：（2） 血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽量避免细菌污染。 血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本底加深，产生假阳性反应。 细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 注意:（3） 冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。 标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均，应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要在混匀器上强烈振荡。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰冻保存。 3.2 试剂的准备 试剂盒成分： 常用的固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之间、同一板各孔之间性能相近。包被抗原或抗体与聚苯乙烯固相载体通过疏水基团作用物理吸附结合。 常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 洗液：非离子型洗涤剂 酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS（一种铵盐），为供氢体。 终止液为硫酸。 在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。 试剂盒中的洗涤液如需在使用时对所提供的浓缩液稀释配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。 3 .3加样本及反应试剂 在ELISA实验中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物和显色剂。 加样必须注意的关键点是： （1）加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。如有气泡，抗原抗体不能有效结合，导致弱阳性甚至假阴性。 （2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。若需稀释血清，应保证稀释液与血清混合均匀。 （3）加酶结合物、加底物，加液量应准确均一、加液过程迅速。可用试剂盒提供的滴瓶直接滴加。滴加时，除要注意滴加的角度垂直一致外，滴加速度也很重要。太快，易出现重复滴加或加在两孔之间的现象。 3.4 温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在一定温度条件下反应一定的时间。一般温育所需时间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。最为常用的温度有37℃和室温(20－25℃)，其次是43℃和2－8℃，目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间通常为37℃ 30－60分钟。  关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点： （1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。 一般来说，加完样本或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能比较长，而在临床实验中，很少有人注意这个问题，通常将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成在实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。 为保证37℃下足够的温育时间，实验室水浴状态应保证微孔板底贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应贴片或封盖。 （2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定抗原抗体反应的本质来看，在较