[生物学]第四章 基因克隆的载体.pptVIP

某些载体的宿主菌带有一个或者两个很强的琥珀突变抑制基因 SupE 在UAG密码子的位置上加上谷氨酰胺 SupF 在UAG密码子的位置上加上酪氨酸 注意这些琥珀突变抑制基因的作用不能互相代替 大容量 减少构建和筛选的重组克隆数 多轮筛选 λ噬菌体载体容量有限 当噬菌体基因组DNA的长度大于野生型λ噬菌体基因 组的105%或小于野生型λ噬菌体基因组的78%时，其存 活力剧降 第三节 粘质粒载体 柯斯质粒载体（35-45Kb） cos site-carring plasmid 带有粘性末端位点（cos）的质粒 使用双cos位点载体c2RB进行的粘质粒克隆 第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒 1、 M13噬菌体的特征 M13、f1和fd长度为6.4Kb，单链环状DNA分子（正义DNA基因组） 仅有的病毒基因组90%以上都编码蛋白质，10个基因中大多数仅以数个核苷酸相隔，仅有两个较长的基因间隔区。 复制 RF 200个拷贝/细胞 1000个子代噬菌体颗粒/ 每个细胞每个世代 2、 M13噬菌体载体 丝状噬菌体的所有基因均为必需基因， 外源基因放在哪里？ 基因间隔区 基因Ⅱ与基因Ⅳ 基因Ⅷ与基因Ⅲ 重组操作 双链DNA 单链DNA 可用于DNA序列分析和位点特异性突变的研究 M13mp18和M13mp19载体的限制酶切图 主要不足之处： 易产生外源DNA片段的部分缺失，且外源DNA越大其缺失频率越高，一般情况下其有效的最大克隆能力仅1500bp 3、噬菌粒（phagemid）： 带有丝状噬菌体复制起点的质粒 可容纳较长的外源DNA片段（约10Kb） 在具有ColE1复制起点及抗生素选择标记的质粒上加上单拷贝的丝状噬菌体主要基因间隔区 噬菌粒图解及克隆位点 超感染 如何保证子代病毒正链DNA主要来自噬菌粒基因组？ 噬菌粒中含有来自野生型M13 DNA的基因间隔区 辅助噬菌体（M13K07）基因组中带有来自M13载体的基因间隔区 第五节 真核细胞用载体 穿梭载体（shuttle vectors） 在原核细胞中复制扩增； 在真核细胞中扩增、表达 基本条件： ①原核基因的复制其始序列和筛选标记 ②真核基因的复制其始序列和筛选标记 ③启动子序列 ④转录终止和polyA加入的信号序列 ⑤限制性内切酶位点 通用的酵母表达载体 重组体借助Aox1的5’及3’区序列整合入宿主细胞 两种典型的酵母（Pichia）表达载体pPIC3和pPIC3K 第六节 人工染色体 1、YAC（酵母人工染色体，yeast artificial chromosome） 在酵母细胞中克隆外源DNA大片段的克隆体系，由酵母染色体中分离出来的DNA复制其始序列（ARS，自主复制序列）、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体 主要缺点： 易出现嵌合体 不稳定 不容易与酵母自身染色体相分离 2、BAC（细菌人工染色体，bacterial artificial chromosome） 3、PAC（P1-derived artificial chromosome） 4、MAC（哺乳动物人工染色体，mammalian artificial chromosome） YAC克隆示意图 各种克隆载体的比较 第四章 基因克隆的载体 载体基本条件： 自我复制 限制性内切酶位点 筛选标记 克隆载体/表达载体 表达载体含有启动子和终止序列 第一节 质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 第三节 粘质粒载体 第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒 第五节 真核细胞用载体 第六节 人工染色体 第一节 质粒载体 1、一般特性 双链闭合环状 松弛型质粒/严紧型质粒 氯霉素、壮观霉素 ColE1复制起点质粒的复制调控 质粒的不相容性 利用同一复制系统的不同质粒不能稳定共存的现象 带pMBI（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录物的方向及其粗略大小 质粒不亲和现象图解 2、比较pBR322和pUC18/19 pBR322质粒限制性内切酶图谱 pUC18/19质粒的限制性内