第三章高效液相色谱及其应用2h2091014.ppt

第3章 高效液相色谱及其应用(2) 3.3 柱分离系统 3.4 HPLC方法开发 3.3 柱分离系统 色谱柱 柱形和柱材 柱填料(固定相) 流动相 流动相的基本组成 溶剂的极性和强度 溶剂的选择性 色谱柱---柱形和柱材 色谱柱 一般用直形优质不锈钢管装填特定的固定相填料而制成(固定相填料一般是：粒径很细的、表面多孔并键合了某种功能团的球形硅胶或球形高分子聚合物；也可直接用全多孔的球形或无定形硅胶）。 标准分析柱 柱管内径一般为2～5mm,长度为150mm，200mm，250mm三种规格较常用；填料粒度5～10μm。 半制备柱或制备柱 内径大于5mm,其填料粒径一般≥10μm，长度一般为150～250mm。 窄径柱 内径一般为2mm左右，长度为50～150mm，填料粒径为3μm左右。 微柱HPLC 分为三类：微径HPLC（柱内径0.5～1.0mm），毛细管HPLC（柱内径100～500μm），纳级HPLC（柱内径10～100μm）;微柱的填料粒径一般为1～2μm,柱长常为5～15cm。 色谱柱---柱填料(固定相) 正相色谱固定相 液固吸附色谱固定相 化学键合正相色谱固定相 反相色谱固定相(均为化学键合相) 其他固定相 凝胶色谱、离子交换、手性拆分、亲和色谱等固定相(这几种也大多为化学键合相) 化学键合相(Chemically bonded phase) 何谓化学键合相?用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上，所形成的填料。 载体主要有两种: (1)硅胶(最常用) ,承受pH范围：一般为2~8 (2)有机高分子聚合物,承受pH范围较宽:pH2~12,甚至1~14 ,但柱效和刚性比硅胶稍差. 目前HPLC除硅胶等吸附色谱柱外,绝大多数固定相为化学键合相. 化学键合相的最大优点是:固定相不易溶解到流动相中 正相色谱键合相 正相色谱固定相应用特性 吸附色谱固定相主要用于分离弱极性脂溶性成分. 流动相一般为正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等)/异丙醇、二氯甲烷(或氯仿)/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。 正相键合相(氨基、氰基、二醇基)既可用上述流动相来分离甘油酯等弱极性有机物,也可以乙腈(甲醇)/水为流动相分离糖、糖醇、糖苷等较强极性的有机物. 样品组分极性愈强,出峰愈迟;流动相极性越强,出峰越早. 反相色谱固定相 表面键合的基团一般为非极性烃基 例如C18或叫ODS是常用的非极性键合相。其键合反应为: ?Si?OH+Cl?Si(R2)?C18H37 ? ?Si?O?Si(R2)?C18H37+HCl 还有C8,C4,C2,C30,苯基等,最常用的是C18和C8. 反相色谱固定相应用特性 适用于分离弱极性、中等极性、较强极性以及可电离的酸碱性有机物.应用最为广泛. 使用极性流动相(常用甲醇/水、乙腈/水、四氢呋喃/水、甲醇或乙腈/缓冲液等) 极性越弱的组分,保留值越大. 流动相有机溶剂/水中,有机溶剂比例越大,则洗脱强度越大,保留值越小. 反相固定相的多样性 反相固定相的保留特性及分离选择性与其键合量(含碳量)、孔径、比表面积等参数及键合种类有关.其峰形与封端等因素有关.稳定性与是否采用侧链立体保护、交联等修饰加固方式有关. 同样是反相C18固定相,由于品牌型号不同，上述参数等不同，因而保留特性及分离选择性等性能差异会很大。 硅胶基质填料上的反相键合相 内嵌极性基团的反相键合相 什么是“疏水塌陷” “疏水塌陷”的另一种描述 凝胶色谱固定相 凝胶色谱（gel chromatography ） 也称体积排阻色谱(size-exclusion chromatography,简称SEC )或凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography,简称GPC）或凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography ,简称GFC）. 凝胶色谱定义和原理:以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离（犹如过筛）的液相色谱方法。 凝胶色谱固定相 填料主要有两大类: 一是无机基质凝胶，一般为二醇型化学键合硅胶，pH范围为2～7.5，如Tskgel G2000SW ，G3000SW，G4000SW系列； 二是有机高分子凝胶，即合成高聚物或多糖型凝胶，合成高聚物的pH范围较宽（2～12），如Ultrahydr